鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)域來源小分子多肽的構(gòu)建

張晨陽，邵冬雪，鄭曦，蘇敬陽，胡聰，佟欣，田興，古麗仙，常心怡，郝麗英

（中國醫(yī)科大學藥學院藥物毒理學教研室，沈陽 110122）

鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）是一種普遍存在的Ca2+傳感器分子，它通過鈣依賴性調(diào)節(jié)方式介導大量蛋白質(zhì)的信號級聯(lián)反應［1］。CaM空間結(jié)構(gòu)呈啞鈴型，由2個球形末端（N-lobe和C-lobe）相連組成，每個結(jié)構(gòu)均由2個Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域（EF-hands）構(gòu)成，每個EF-hand結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合1個鈣離子［2］，其中N-lobe包括EF-hand 1和EF-hand 2結(jié)構(gòu)域，C-lobe包括EF-hand 3和EF-hand 4結(jié)構(gòu)域。

電壓門控鈣離子通道（the voltage-gated Ca2+channels，CaVs）通過控制細胞鈣離子流入在許多細胞中發(fā)揮重要作用［3］。CaVs開關(guān)受Ca2+調(diào)節(jié)，包括鈣依賴性 易化（Ca2+-dependent facilitation，CDF）和鈣依賴性失活（Ca2+-dependent inactivation，CDI）調(diào)節(jié)機制［4］。當細胞內(nèi)鈣離子濃度升高或發(fā)生反復短暫去極化時，CDF會增強鈣通道的開放度；CDI是Ca2+內(nèi)流持續(xù)增加時鈣通道失活的過程，有助于防止鈣超載［5］。CDI發(fā)生可以由CaM和CaV1.2鈣離子通道α1亞單位的C末端（包括EF-hand，preIQ和IQ基序）結(jié)合而介導［6-8］，但CaM各EF-hand結(jié)構(gòu)域的作用機制還有待進一步研究。目前研究［9-10］發(fā)現(xiàn)，位于或接近于C-lobe的EF-hand 4結(jié)構(gòu)域內(nèi)某些位點突變可引起CDI異常，從而可能導致心律失常等心血管疾病。本研究通過固相合成法構(gòu)建CaM結(jié)構(gòu)域來源小分子多肽（EF-hand 4，a.a 113-148），為進一步探討CaM結(jié)構(gòu)域來源EF-hand 4在CDI中的作用機制及生物學功能提供材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

EF-hand 4（南京肽業(yè)合成），氨基酸序列為GEKLTDEEVDEMIREADIDGDGQVNYEEFVQMMTAK；丙烯酰胺（acrylamide，Acr）、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺、三（羥甲基）甲基甘氨酸［N-tris（hydroxymethyl）methylglycine，Tricine］、三（羥甲基）氨基甲烷［tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris］、十二烷基 硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甘油、過硫酸銨（ammonium persulphate，AP）、TEMED、溴酚藍、巰基乙醇、考馬斯亮藍R250、乙醇、冰醋酸均為國產(chǎn)分析純試劑；蛋白標準品（Marker，Prestained Protein Lader，Product#26619，美國Thermo公司）；超純水。電泳儀和Min-protein垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司），凝膠成像儀（Microteck掃描儀，上海中晶科技有限公司）。

1.2 Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳

1.2.1 溶液配制：Tricine-SDS-PAGE 凝膠貯存液和Tricine-SDS-PAGE 電泳緩沖液配制見表1、2。

表1 Tricine-SDS-PAGE 凝膠貯存液（g）Tab.1 Stock solutions for Tricine-SDS-PAGE（g）

1.2.2 凝膠配制：Tricine-SDS-PAGE分離膠和濃縮膠配制見表3。

表3 16.5%T分離膠和濃縮膠配制表（mL）Tab.3 Composition of 16.5%T separation gel and stacking gel（mL）

1.2.3 電泳：取EF-hand 4（0.45 mg/mL）10 μL，加入2 μL PBS和3 μL樣品緩沖液（×5）；以12 μL PBS加3 μL樣品緩沖液（×5）作為陰性對照。上樣前煮沸5 min。將正極緩沖液（×10）、負極緩沖液（×10）稀釋，Tricine-SDS-PAGE內(nèi)槽倒入稀釋的負極緩沖液（×1），外槽倒入稀釋的正極緩沖液（×1）。取蛋白標準品（2 μL）加樣，EF-hand 4樣品（15 μL）加樣。濃縮膠恒壓（60 V）電泳，樣品進入分離膠后保持恒壓（120 V）電泳，至溴酚藍指示劑遷移到凝膠底部時結(jié)束電泳。考馬斯亮藍R250染色液染色過夜，脫色液脫色至條帶清晰，背景干凈，凝膠掃描儀掃描拍照。同樣方式處理EF-hand 4樣品并于常規(guī)15% 甘氨酸（glycine）-SDS-PAGE凝膠中上樣，正常電泳后染色、脫色，掃描膠圖。

1.3 GST pull-down

分別取GST-IQ 40 μL于6個EP管（容積2 mL）內(nèi)，依次加入0.10、0.35、0.70、1.40、2.10、3.50 μmol/L的EFhand 4，在2 mmol/L ［Ca2+］條件下4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育4 h。將孵育好的樣品800 r/min離心3 min，用含2 mmol/L［Ca2+］的Tris 緩沖液洗2遍，加入15 μL樣品緩沖液，煮沸5 min，上清加入16.5% Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，檢測EF-hand 4生物活性。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜分析EF-hand 4

質(zhì)譜檢測EF-hand 4結(jié)果顯示，［M-3H］3-、［M-4H］4-、［M-5H］5-、［M-6H］6-的質(zhì)荷比分別為1 377.50、1 033.15、826.40、688.35，計算可得小分子多肽分子量為4.13×103。見圖1。

圖1 EF-hand 4質(zhì)譜分析報告Fig.1 Mass spectrum of EF-hand 4

2.2 Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳檢測EF-hand 4分子量和純度

15% Glycine-SDS-PAGE電泳對EF-hand 4進行檢測，膠圖顯示10×103處可見清晰條帶，與理論值4.13×103相差較遠，說明15% Glycine-SDS-PAGE無法對EF-hand 4進行分離檢測。見圖2A。

Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果如圖2B所示，在約4×103處見清晰蛋白條帶，為EF-hand 4，與質(zhì)譜得到的分子量結(jié)果一致。CS Analyzer 3.0軟件分析Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳條帶灰度值及其純度結(jié)果顯示，EF-hand 4有1個明顯的主峰圖（2C），軟件分析結(jié)果表明其灰度值為11 220，所占比例為100%，即經(jīng)Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳檢測該多肽純度為100%。表明Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳法可以有效檢測EF-hand 4分子量及純度。

圖2 EF-hand 4電泳結(jié)果及其Tricine-SDS-PAGE電泳條帶分析結(jié)果Fig.2 Tricine-SDS-PAGE electrophoresis and analysis results of EF-hand 4

2.3 GST pull-down鑒定EF-hand 4活性

GST pull-down實驗結(jié)果顯示，EF-hand 4在2 mmol/L ［Ca2+］條件下能夠和GST-IQ呈濃度依賴性結(jié)合，表明經(jīng)固相合成法合成的EF-hand 4具有與CaV1.2通道結(jié)合的生物活性。見圖3。

圖3 EF-hand 4與GST-IQ結(jié)合的Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.3 Tricine-SDS-PAGE electrophoresis of EF-hand 4 bound to GST-IQ

3 討論

Glycine-SDS-PAGE電泳是用于蛋白質(zhì)分析檢測的常用技術(shù)之一，有效分離范圍取決于聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度，可以有效分離分子量為（10～200）×103的蛋白，但是較高濃度的聚丙烯酰胺凝膠也難以有效分離10×103以下的蛋白，且蛋白條帶容易擴散丟失［11］。本研究采用Tricine代替Glycine，并在分離膠中加入甘油，能夠有效濃縮小分子肽蛋白，特別是在低丙烯酰胺濃度下分離（1～20）×103的蛋白質(zhì)效果較好［11-12］。Tricine-SDSPAGE彌補了Glycine-SDS-PAGE凝膠對于小分子多肽分離度不高的缺點，建立了一種可以快速、直觀、方便且相對準確鑒定EF-hand 4的電泳方法。

CaM是一種Ca2+結(jié)合蛋白，可以參與調(diào)節(jié)許多與心臟生理病理學相關(guān)的靶點，對細胞的生存及生長至關(guān)重要［13］。CaM突變可引起心律失常（兒茶酚胺能性多態(tài)室性心動過速、長QT綜合征等），然而導致心律失常的CaM 突變體對細胞活力和心律的具體影響還不明確，有研究顯示位于C-lobe的EFhand 4結(jié)構(gòu)域的某些位點突變與心臟生理疾病相關(guān)［13-17］。本研究僅初步檢測了EF-hand 4可以結(jié)合到CaV1.2通道IQ片段，EF-hand 4與CaV1.2通道結(jié)合后能否起到調(diào)節(jié)通道功能的作用以及如何調(diào)節(jié)通道功能還需要深入研究，能否用于因EF-hand 4結(jié)構(gòu)域位點突變相關(guān)的心臟疾病防治也有待進一步探討。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了EF-hand 4，而且EF-hand 4具有較高的純度和與CaV1.2通道結(jié)合的生物學活性，為深入研究CaM結(jié)構(gòu)域來源EF-hand 4的生物學功能提供了材料基礎(chǔ)，可用于CaM 突變體誘發(fā)心律失常等疾病機制、治療和預防等相關(guān)研究中。