西藏產區葡萄表皮及根際土壤真菌群落結構組成分析

張二豪，趙潤東，尹 秀，蔡 皓，祿亞洲，羅 章

（西藏農牧學院食品科學學院，西藏林芝 860000）

西藏昌都市芒康縣和林芝市位于西藏東南部，該地區具有光照充足、陽光輻射強、土壤砂質深厚、晝夜溫差大等獨特的生態環境，為葡萄種植提供了得天獨厚的環境條件，以此原料釀造的葡萄酒香氣濃郁、口感飽滿，因此，素有“中國野生紅葡萄之鄉”和“西藏紅酒之鄉”之稱。

根際土壤微生物是葡萄園生態系統中的重要組成成分，在土壤能量轉化和物質代謝等方面扮演著重要角色[1]。根際存在多種對植物有益的微生物類群，如生防菌、固氮菌及能產生植物生長激素的微生物，對植物生長發育、物質吸收和能量代謝影響較大，因此，其微生物多樣性是土壤質量的重要評價指標[2?4]。葡萄表皮上的微生物復雜多樣，其微生物群落結構組成對后續葡萄酒釀造及葡萄酒品質會產生一定的影響[5]。Bedriana等[6]研究表明，本土酵母與釀酒酵母共同發酵培養時，芳香類化合物含量顯著增加，Bokulich等[7]在研究增芳德葡萄表皮微生物時發現Candida zemplinina真菌能夠增強葡萄酒的感官品質。葡萄根際土壤及葡萄表皮微生物群落結構組成受地理因素、氣候條件、葡萄品種和土壤理化性質等因素影響，魏玉潔等[8]在研究新疆產區葡萄果實、葉片及根際土壤微生物多樣性時發現葡萄園地理位置不同，其微生物多樣性存在差異，且Saccharomyces、Sordaria、Tetracladium和Geomyces是土壤中的優勢真菌屬，而葡萄表皮真菌以Aureobasidium、Cryptococcus、Aspergillus和Sporospora為主；王偉等[9]發現新疆四大產區葡萄園土壤微生物多樣性存在顯著差異，且Guehomyces、Gibberella和Tetracladium是土壤真菌的優勢類群。楊敏等[10]發現香格里拉產區不同葡萄園間根際土壤菌群豐度存在差異，且土壤微生物群落受土壤電導率、有機質和速效鉀含量影響；張世偉等[11]研究表明葡萄品種是影響其表皮微生物多樣性的重要因素。綜上所述，葡萄表皮及根際土壤微生物群落結構組成與其生長環境和葡萄品種等諸多因素有關。西藏獨特的地理位置和氣候環境，蘊藏著豐富的微生物資源，研究葡萄表皮及根際土壤真菌群落結構組成，對篩選和利用葡萄酒產區特色微生物具有重要意義。目前，有關國內外產區葡萄表皮、根際土壤微生物的研究較多[7?10,12]，而西藏產區葡萄表皮及根際土壤微生物的研究尚未見報道。

高通量測序技術由于其通量大、準確性高、能基本反映自然界中微生物的真實情況等優點，在生物學研究中得到廣泛的應用和發展[13?14]。因此，本文采用高通量測序技術對西藏昌都芒康和林芝2個產區黑珍珠葡萄園中的釀酒葡萄表皮和根際土壤真菌群落結構組成及多樣性進行研究，揭示不同產區核心微生物菌群的作用，以期為篩選利用本土特色釀酒微生物提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黑珍珠葡萄及葡萄根際土壤 于2019年9月分別從林芝市（緯度29°25'33.37"N，經度94°26'50.93"E）和昌都市芒康縣（緯度29°1'53.1"N，經度98°36'21.77"E）采集并將樣品命名如下：LG-林芝葡萄，MG-芒康葡萄，LS-林芝葡萄根際土壤，MS-芒康葡萄根際土壤；DNeasy Plant Mini Kit Qiagen,Germantown,MD，USA；2×Taq Master Mix，DNA片段純化試劑盒 天根生化科技有限公司；真菌通用引物（ITS1和ITS2） Invitrogen公司。

Eppendorf 5424R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Bio-Rad T100 PCR儀 美國Bio-Rad公司；電泳儀 北京六一；NanoDrop2000微量分光光度計 美國Thermo公司；漩渦混合器XH-D沃信公司；Illumina Misq 測序平臺 美國Illumina 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 隨機選取20株生長良好的黑珍珠葡萄植株，并用無菌剪刀采集同一葡萄植株上、中、下3個部位的果實，置于無菌袋中，并混合均勻，低溫運輸至實驗室，?20℃保存備用；按照田間根際土壤樣品采集方法采集根際土壤樣品[15]，除去雜質并混合均勻，每組3個重復，放入無菌袋中，低溫保存并帶回實驗室，?20℃保存備用。

1.2.2 根際土壤理化性質分析 按照《土壤農化分析》[16]操作步驟測定根際土壤樣品中的總磷（TP）、總鉀（TK）、總氮（TN）、有效磷（AP）、有效氮（AN）、p H、電導率（EC）和有機質（SOM）含量。

1.2.3 樣品總DNA提取 稱50 g葡萄果實，加入200 mL PBS緩沖液（0.1 mol/L，p H7.0），200 r/min渦旋振蕩30 min，超聲15 min，0.22μm（Millipore，USA）微孔濾膜過濾，用無菌剪刀剪碎濾膜并放入無菌離心管中[11]。按照DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen,Germantown,MD，USA）操作步驟提取新鮮葡萄表皮和根際土壤樣品總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的質量，并在NanoDrop ND-2000紫外分光光度計下檢測所提DNA的濃度和純度。

1.2.4 樣品PCR 利用真菌轉錄間隔區（ITS）的通用引物對核糖體DNA的ITS1-ITS2區域進行PCR擴增，引物為ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA）和ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）。PCR反應擴增體系（20 μL）如下：10×PCR Buffer 2.0 μL，10 mmol/L ITS1F和ITS2R引物各1μL，5 mmol/L dNTPs 1μL，5.0 U/μL rTaq酶0.2 μL，DNA模板1μL，補dd H2O至20μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，純化后委托上海美吉生物醫藥有限公司進行高通量測序。

1.3 數據處理

利用QIIME（Version 1.9.1）對Illumina MiSeq測序所得原始數據進行去雜、優化、α多樣性和主坐標分析（Principal coordinates analysis，PCoA）；α多樣性指數包括Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數和均勻度指數（Shannoneven），其中Chao1指數值越大，說明豐富度越高；Shannon指數值越大，Simpson指數值越小，說明群落多樣性越高；在97%相似度下，利用UPARSE（7.0.1090）軟件進行OTU聚類；通過RDP classifer（Version 11.5）軟件將OTU代表序列與真菌UNITE數據庫比對，進行物種注釋并統計各樣本在各分類水平下的相對豐度和群落組成；利用Mothur（Version 1.30.2）軟件進行α多樣性分析；利用R語言進行韋恩圖、冗余分析（RDA，redundancy analysis）和熱圖制作。

2 結果與分析

2.1 樣品根際土壤理化性質分析

根際土壤理化性質由表1可知，MS樣品中的總磷（TP）、總氮（TN）、速效氮（AN）、電導率（EC）和土壤有機質（SOM）含量均顯著高于LS，而MS樣品中的速效磷（AP）含量顯著低于LS（P<0.05），但兩地樣品中的總鉀（TK）含量無顯著差異，兩地土壤pH差異顯著（P<0.05），LS土壤偏酸性，而MS土壤偏堿性。

表1 樣品根際土壤理化性質分析Table 1 Physical and chemical properties of rhizosphere soil samples

2.2 樣品真菌群落多樣性分析

本研究共獲得546888條有效序列，隸屬12門，37綱，86目，176科，357屬；LG、MG、LS和MS樣品所產生的OTUs數分別為114、150、297和794。LG樣品中所獲得的OTUs低于MG，MS樣品中所獲OTUs顯著大于LS。稀釋曲線分析結果如圖1A所示，隨著測序深度的增加，稀釋曲線逐漸趨于平坦，各樣本的測序覆蓋度均大于99.99%，說明此次測序結果能基本反映樣品中真菌群落結構組成的真實情況。韋恩圖分析結果如圖1B所示，4個樣本中共獲得的物種數為1008種，共同擁有的物種數為22種，LG和MG共同擁有的物種數為46種，LS和MS共同擁有的物種數為140種，LG、MG、LS和MS樣品中特有物種數分別為17、47、121和593種。α多樣性分析結果如表2所示，MS樣品中真菌群落多樣性和豐富度指數最高，MG樣品中真菌群落均勻度指數最高，而LG樣品中真菌群落多樣性、豐富度和均勻度指數最低。總體而言，芒康地區葡萄和根際土壤真菌種類最多，多樣性指數最高，這可能與芒康土壤性質有關，芒康葡萄園土壤以腐殖土為主，而林芝葡萄園土壤以沙土為主。

表2 樣品真菌群落多樣性Table 2 Fungal diversity indexes in different samples

圖1 稀釋曲線（A）和OTU韋恩圖（B）Fig.1 Rarefaction curves（A）and Venn chart of OUT（B）

2.3 樣品真菌群落組成分析

樣品真菌在門分類水平相對豐度如圖2所示，不同樣品真菌群落結構在門分類水平組成差異較大，LG樣品門數最少，為2個門，MS最多，為11個門。子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）在不同樣品中廣泛存在，它們的相對豐度分別為76.06%～99.60%、0.40%～12.21%。Mortierellomycota是MS中的次優勢菌門，其相對豐度為20.17%，壺菌門（Chytridiomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、芽枝霉門（Blastocladiomycota）和Kickxelomycota是MS樣品中特有的門，其平均相對豐度分別為0.12%、0.06%、0.01%和0.003%，而Mucoromycota是LS樣品中特有的門，其平均相對豐度為0.03%。

圖2 樣品真菌門分類水平群落結構組成Fig.2 Composition of fungal community in the samples at phylum level

屬分類水平群落結構組成如圖3所示，枝孢屬（Cladosporium）和青霉屬（Penicilium）是LG樣品中的優勢屬，其平均相對豐度分別為64.43%和23.31%；MG樣品中的優勢屬是漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、枝孢屬（Cladosporium）和畢赤酵母屬（Pichia），其平均相對豐度分別為31.59%、26.78%和18.71%；鐮胞菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicilium）和枝孢屬（Cladosporium）是LS樣品中的優勢屬，其平均相對豐度分別為50.02%、10.15%和8.18%；MS樣品中的優勢屬是被孢霉屬（Mortierella）、unclassified_f_Didymellaceae和青霉屬（Penicilium），其平均相對豐度分別為20.16%、10.72%和7.82%。樣本聚類分析表明，不同地區的葡萄表皮和不同地區的根際土壤真菌被聚為一類。以上結果表明，不同樣品中的優勢屬群落結構組成差異較大，而不同地理位置環境下的葡萄表皮和根際土壤真菌群落組成相似。

圖3 樣品真菌屬分類水平群落結構組成熱圖Fig.3 Composition of fungal community in the samples at genuslevel

2.4 樣品真菌群落聚類分析

主成分分析（Principal coordinate analysis）結果如圖4所示，主成分分析PC1和主成分分析PC2對群落結構組成差異的貢獻率分別為39.98%和24.48%，合計64.46%，是差異的主要來源，能夠很好的區分不同地區的葡萄和根際土壤樣品。樣本層級聚類分析如圖5所示，不同地區的葡萄樣品和根際土壤樣品聚為一類，說明不同地區的葡萄和不同地區的根際土壤樣品真菌群落結構組成相似。

圖4 真菌群落PCA分析Fig.4 Principal coordinate analysis of fungal communities

圖5 UPGMA聚類分析Fig.5 UPGMA cluster analysis

2.5 門分類水平樣品真菌群落結構與環境因子冗余分析

土壤理化性質對真菌群落結構的影響如圖6所示，TK、TP、AN、TN和p H對真菌群落結構組成有影響，其中TK影響最大，而AP、SOM和EC不影響真菌群落結構組成；MG樣品真菌群落結構與TP、AN、TN和pH呈正相關，而與TK呈負相關，LG和MS則相反，LS樣品與TK呈正相關，而與TP、AN、TN和pH呈負相關。在門分類水平上，子囊菌門（Ascomycota）豐度變化與TK、TP、AN、TN和p H呈負相關，而Mortierellomycota豐度變化與TP、AN、TN和TK呈正相關，與p H呈負相關，而擔子菌門（Basidiomycota）豐度變化與TP、AN、TN和pH呈正相關，而與TK呈負相關。

圖6 真菌群落結構與環境因子的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis biplot between the fungal community and environment factor

3 討論與結論

本研究利用Illumina Miseq測序技術對西藏產區昌都芒康縣和林芝市兩個地區的葡萄表皮及根際土壤真菌群落結構進行分析。結果表明，MS樣品中的總磷、總氮、速效氮、電導率和土壤有機質含量均顯著高于LS，這可能與土壤類型有關，MS以腐殖質為主，而LS以沙土為主；有研究表明，根際土壤作為一個天然的微生物資源庫，為微生物生長提供必需的營養物質[8,17]，楊敏等[10]發現香格里拉產區葡萄根際土壤微生物群落受土壤電導率、有機質和速效鉀含量影響。在門分類水上，子囊菌門（Ascomycota）是葡萄表皮和根際土壤真菌的優勢菌門，Pinto等[18]和Stevanato等[19]研究表明，子囊菌門（Ascomycota）是葡萄和根際土壤真菌的優勢類群，這與本文研究結果一致。MS樣品中檢測到的真菌門最多，而LS樣品中檢測到相對較少的真菌門，這可能是兩地土壤理化性質有關[20?23]。在屬分類水平上，枝孢屬（Cladosporium）和青霉屬（Penicilium）是LG樣品中的優勢屬，而MG樣品中的優勢屬是漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、枝孢屬（Cladosporium）和畢赤酵母屬（Pichia），兩地葡萄表皮真菌差異較大，這可能與兩地葡萄栽培、管理和殺菌劑等因素有關[24]。魏玉潔等[8]在研究新疆產區葡萄果實時發現葡萄表皮真菌以Aureobasidium、Cryptococcus、Aspergillus和Sporospora為主，趙昱等[25]研究表明短梗霉屬（Aureobasidium）和紅酵母屬（Rhodotorula）是四個產區赤霞珠葡萄表皮真菌的優勢屬，與本文研究結果差異較大，可能與氣候環境和葡萄品種等因素有關。兩地根際土壤真菌群落組成差異較大，土壤微生物群落結構和功能受果園土壤理化性質及果園果樹自身種類、覆草、施肥、農藥等因素影響[26?27]，因此以上因素可能是導致兩地根際土壤真菌群落組成差異的關鍵因素。α多樣性分析發現，MS樣品真菌多樣性、均勻度和豐富度指數明顯高于LS，且MG明顯高于LG，可能與兩地土壤理化性質、施肥及水源等因素有關，張翔等[28]研究發現生物有機肥可顯著提高果園土壤微生物的豐富度和多樣性，趙昱[25]研究發現不同產區釀酒葡萄微生物存在的差異性可能與氣候、水源、栽培等因素有關，楊敏等[10]研究發現氣候和土壤差異可能是導致根際微生物差異的重要原因。

眾所周知，酵母菌是葡萄酒釀造的關鍵菌株，目前已報道的與釀酒相關的酵母菌高達24屬120余種。酵母菌在釀造過程中能夠將糖類物質轉化為乙醇及其他次生代謝產物并釋放多種香氣物質，同時能夠抑制細菌生長；Bedriana等[6]研究表明，本土酵母與釀酒酵母共同發酵能夠增加芳香類化合物和風味物質的合成，提高葡萄酒的香氣，本文在MG樣品中檢測到大量漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、Metschnikowia、Vishniacozyma和畢赤酵母屬（Pichia），說明芒康地區葡萄富含與釀酒相關的酵母菌，可為本地釀酒酵母菌株的篩選、開發和利用提供理論依據。

本研究通過高通量測序技術對西藏兩個地區葡萄表皮和根際土壤真菌群落結構組成的進行分析。結果表明，兩地土壤理化性質差異較大，RDA分析可知，總磷、總氮和速效氮對真菌群落結構組成影響較大；MS樣品真菌多樣性、均勻度和豐富度指數均明顯高于LS，且MG明顯高于LG；在門水平，各樣品中的優勢菌是子囊菌門（Ascomycota），在屬水平，各樣品的優勢屬差異較大，枝孢屬（Cladosporium）、漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、鐮胞菌屬（Fusarium）和被孢霉屬（Mortierella）分別是LG、MG、LS和MS樣品的優勢屬；主成分分析及樣本聚類分析表明，不同地區的葡萄表皮和根際土壤真菌群落組成相似，這可能與樣品特異性等因素有關；同時在芒康地區發現較多與釀酒相關的酵母菌，可為本地釀酒菌株的篩選和利用提供理論依據。