大鯢活性肽對D-半乳糖致小鼠機體氧化損傷的修復作用

關百婷，李 偉，趙 菲，佟長青

（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧大連 116023）

大鯢（Andrias davidianus），屬于兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，是我國特有的珍稀兩棲動物，屬于國家二類保護動物[1]。大鯢不僅有豐富的營養，而且還體虛、貧血、痢疾等疾病[3]。研究表明，大鯢含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸、多糖、礦物質元素等成分[4]。這些營養物質構成了大鯢活性成分的物質基礎。大鯢肌肉中蛋白質含量高，氨基酸比例合理，種類豐富。大鯢肌肉蛋白質經過酶解過程可以獲得具有抗氧化、免疫調節等生物活性的大鯢活性肽[5?7]，適用于大鯢肽相關產品的開發。

衰老是多細胞生物體在發育成熟后受多因素作用的生理機能退行性過程，主要有自由基、免疫、端粒細胞與神經內分泌等學說解釋機體的衰老原因，但主流的解釋為自由基攻擊等氧化反應導致機體衰老[8]。因機體內臟器受氧化物攻擊，產生有毒有害物質無法及時清除，產生一系列生理生化應激反應，進而導致表觀上、生理上的退行性衰老。研究表明，長期大量對動物注射D-半乳糖溶液，過多的D-半乳糖在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇，半乳糖醇不能被機體代謝，堆積在細胞內的半乳糖醇可以導致細胞的氧化應激反應，進而導致細胞內活性氧（reactive oxygen species,ROS）增加[9]。過多的ROS引起細胞損害，導致機體多器官、多系統功能減退[10?11]。D-半乳糖可以使機體的很多組織出現類似衰老的退行性改變，出現與衰老相關的毛色變暗、行動遲緩等體征、生化改變、免疫功能下降、退行性神經功能紊亂，還出現胰腺損傷、腦損傷以及腎臟損傷[2?15]。因此，D-半乳糖致小鼠衰老模型被廣泛用來評價各種生物活性成分的抗衰老作用。

目前，對大鯢肌肉的營養成分進行分析的研究報道較多。對大鯢肽的酶解制備工藝及其具有抗氧化活性的研究也有報道[16?17]。但鮮有對大鯢肽的抗衰老作用的深入研究。本實驗采用D-半乳糖皮下注射建立小鼠亞急性衰老模型以及非定量標記蛋白質組學技術研究大鯢肽的抗衰老作用，以期從分子水平上闡明大鯢活性肽抗衰老機理，為大鯢的高值化開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SPF小鼠 體重18～22 g，大連醫科大學實驗動物中心，生產許可證SCXK（遼）2013-0003；大鯢活性肽 分子量1400～2000 Da，由遼寧省水產品加工及綜合利用重點實驗室制備；D-半乳糖 國藥集團化學試劑有限公司；總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

5430R低溫高速離心機、真空離心濃縮儀 Eppendorf公司；Q exactive質譜儀Thermo Scientific公司；Triple TOF 6600+質譜儀AB SCIEX公司；Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀 Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 D-半乳糖致小鼠衰老模型的建立、給藥和處理 將60只SPF級昆明小鼠（雄性）分為5組，分別為正常組、衰老模型組，大鯢活性肽低、中、高劑量組，對應劑量分別為：100、200、400 mg/（kg·d）。除正常組每天注射等體積生理鹽水外，其他各組每天都單次皮下組織注射5%D-半乳糖0.5 mL/d（生理鹽水配制）。每周記錄1次小鼠體重。大鯢活性肽低、中、高劑量組每日按0.1 mL大鯢活性肽水溶液/20 g小鼠體重分別灌胃一次，正常組和衰老模型組以生理鹽水代替大鯢活性肽水溶液進行灌胃，同時觀察小鼠毛色與行動。連續灌胃6周后，稱重，摘取眼球取血，立即離心（3000 r/min，10 min），取上層血清，?20℃冰箱凍存備用。

1.2.2 小鼠組織臟器指數測定 小鼠稱重后處死，快速取出腦、肝臟、胸腺和脾4種臟器，用濾紙吸干血水，電子天平上稱重。按照式（1）計算肝臟指數、腦指數、胸腺指數和脾指數。

1.2.3 生化指標測定 小鼠血清中總抗氧化（T-AOC）能力、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的測定，按試劑盒說明書的操作步驟進行。

1.2.4 蛋白質組樣品制備 取50μL大鯢活性肽中劑量組和D-半乳糖致小鼠衰老模型組小鼠血清，均采用去血清高豐度親和色譜柱Agilent Multiple Affinity Removal LC Column-Mouse 3（4.6 mm×100 mm，1.66 mL），獲得小鼠血清中低豐度蛋白組分。各樣品血清低豐度蛋白組分經過超濾濃縮后加入等體積SDT裂解液，沸水浴裂解15 min，于14000×g條件下離心20 min。采用BCA法對上清液進行定量。大鯢活性肽中劑量組小鼠血清樣品標記為ADB-T，D-半乳糖致小鼠衰老模型組小鼠血清樣品標記為ADB-M。

1.2.5 SDS-PAGE電泳 取裂解后的各樣品分別取20μg，分別加入等體積2×上樣緩沖液，沸水浴5 min，取20μL進行12.5%SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮藍染色后脫色液脫色，判斷樣品裂解情況。

1.2.6 樣品酶解 采用Filter aided proteome preparation （FASP）方法對各樣品進行酶解[18]。分別取樣品ADB-T及ADB-M各30μL蛋白質溶液，分別加入0.003 mmol DTT，沸水浴5 min后冷卻至室溫。加入200μL尿素緩沖液（8 mol/L尿素，150 mmol/L Tris-HCl，p H8.0）混勻后，在10 k D超濾離心管中于14000×g離心15 min，棄濾液（重復該步驟一次）。加入100μL 100 mmol/L IAA緩沖液（以尿素緩沖液溶解），在600 r/min條件下振蕩1 min，室溫避光30 min后于相同離心條件下進行離心。加入100μL尿素緩沖液，相同離心條件下離心，該步驟重復兩次。加入100μL 25 mmol/L NH4HCO3溶液，相同離心條件下離心兩次。加入40μL 0.1 g/L胰蛋白酶緩沖液（以100 mmol/L NH4HCO3溶液配制），600 r/min振蕩反應1 min，37℃靜置16 h。換新收集管，相同離心條件下離心；再加入40 μL 25 mmol/L NH4HCO3，在相同離心條件下離心并收集濾液。通過C18Cartridge脫鹽凍干后以40 μL 0.1%甲酸溶液復溶，測定280 nm吸光值[19]。

1.2.7 LC-MS/MS分析 根據FASP酶解后OD280定量結果，各取2μg酶解后的ADB-T及ADB-M進行LC-MS/MS分析。樣品先經過RP-C18毛細管高效液相色譜柱（Thermo EASY column SC200 150 μm×100 mm）的納升流速HPLC液相系統EASY-nLC1000，以甲酸乙腈水溶液進行梯度分離。預柱為RP-C18Thermo EASY column SC001 traps 150μm×20 mm。A液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為2%），B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。梯度條件為：0～100 min，B液線性梯度0%～45%；100～108 min，B液線性梯度45%～100%；108～120 min，B液維持在100%[19]。分離后用Q-Exactive質譜儀進行質譜分析[15]。預分析時長60 min，正式分析時長120 min。

1.2.8 Max Quant的數據分析 質譜分析原始數據為RAW文件，采用Max Quant軟件（版本號1.3.0.5）[20?21]進行查庫鑒定，并根據Label free算法進行定量分析[22]。

1.2.9 Gene Ontology（GO）功能注釋 利用Blast-2GO[23]對目標蛋白質集合進行GO注釋。利用NCBI BLAST+ （ncbi-blast-2.2.28+-win32.exe）比對小鼠血清數據庫，保留E值小于等于0.001的前10條。再依次通過提取、注釋。

1.2.10 KEGG通路注釋KEGG Automatic Annotation Server軟件[24]獲取目標蛋白質序列參與的通路信息。通過Fisher精確檢驗評價GO term或KEGG通路蛋白質富集度的顯著性水平。

1.2.11 蛋白質聚類分析（Clustering） 對目標蛋白質定量信息歸一化處理后，進行蛋白質聚類分析。

1.3 數據處理

數據處理采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，結果表示為平均值±標準差，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠體質變化情況及臟器指數

各組小鼠在實驗前，皮毛光滑，喜攀爬、嚙咬樹枝。衰老模型組小鼠連續6周每天皮下組織注射5%D-半乳糖0.5 mL后，小鼠毛色變暗，行動遲緩，攀爬行為減少等變化。該結果與黃杰等[13]建立D-半乳糖致衰老小鼠的反應與狀態變化結果相似。衰老模型組小鼠體重僅增加56.18%，正常小鼠體重增60.30%，增加量低于正常組（圖1）。灌胃低、中、高濃度大鯢活性肽水溶液各組小鼠平均體重高于模型組，趨近于正常組，但未表現出劑量依賴性，表明大鯢活性肽在低劑量情況下具有促進衰老小鼠恢復生長作用。

圖1 大鯢活性肽對小鼠體質量的影響Fig.1 Effect of giant salamander bioactive peptideson body weight of mice

各組SPF級雄性昆明小鼠灌胃對應大鯢活性肽溶液6周后，小鼠臟器指數變化如表1。由表1可以看出，各灌胃大鯢活性肽組的腦指數、胸腺指數與正常組相比不顯著（P>0.05）；中劑量組的脾指數顯著高于正常組（P<0.05）；低、高劑量大鯢活性肽組的肝指數均極顯著低于模型組（P<0.01）。灌胃大鯢肽后，小鼠的脾臟指數增加，表明大鯢肽在一定程度上可以增強小鼠機體免疫功能。

表1 大鯢活性肽對小鼠臟器指數的影響Table 1 Effect of giant salamander bioactive peptides on organ indexes for each group of mice

2.2 生化指標檢測

對小鼠血清中MDA含量、SOD活力和T-AOC進行測定，結果見表2。由表2可見，與模型組相比，灌胃大鯢活性肽中、高劑量組小鼠血清中MDA含量極顯著降低（P<0.01），并且SOD活力和T-AOC顯著升高（P<0.05）。注射D-半乳糖致小鼠衰老后，小鼠血清中MDA含量極顯著上升，SOD活力和T-AOC極顯著降低（P<0.01），而在灌胃大鯢活性肽后，顯著改善小鼠這些生化指標，但未發現劑量依賴性。因此，大鯢活性肽具有抗D-半乳糖致小鼠衰老作用。

表2 大鯢活性肽對小鼠生化指標的影響Table 2 Effect of giant salamander bioactive peptides on the levels of serum markers in SPFmice

2.3 血清樣品SDS-PAGE和質譜檢測

SDS-PAGE（圖2A）結果表明，未經去除血清高豐度親和色譜柱處理的中劑量組小鼠血清蛋白（ADB-T2-3原）中60 kDa附近蛋白含量過高而影響低豐度蛋白質分析，而去除高豐度血清蛋白后模型組（ADB-M-1、ADB-M-2、ADB-M-3）和的大鯢活性肽中劑量組（ADB-T2-1、ADB-T2-2、ADB-T2-3）電泳條帶清晰，平行性好，可進行質譜分析。質譜分析Basepeak結果（圖2B和圖2C）表明，組間樣本平行性好，酶解效果良好，可進行非標記定量質譜測定。

圖2 小鼠血清樣本平行性Fig.2 Samples parallelism of proteinsin serum in mice

2.4 蛋白質鑒定結果統計

模型組與中劑量組共鑒定到蛋白質425個，其中差異表達蛋白26個，通過大鯢活性肽治療后，差異表達蛋白質表達上調13個（表3），下調13個（表4）。其中胞質四氫葉酸合成酶（存取編號：Q922D8）和肌糖原磷酸化酶顯著增加，黃嘌呤脫氫酶（氧化酶）（存取編號：Q00519）顯著減少。四氫葉酸作為生物體中的一碳單位轉移酶的輔酶，在氨基酸代謝和核酸代謝中起重要作用。糖原磷酸化酶催化糖原轉變為1-磷酸葡萄糖，補充體液中葡萄糖。黃嘌呤脫氫酶在核酸代謝過程中起重要作用，可催化黃嘌呤轉變為尿酸。

表3 上調的差異表達蛋白質Table3 Up-regulated proteinswith significant differences

表4 下調的差異表達蛋白質Table 4 Down-regulated proteins with significant differences

以治療組對模型組表達倍數與t檢驗P值作圖，顯示兩組間蛋白質表達差異顯著性的火山圖如圖3所示，圖中橫坐標大于1且縱坐標大于1.3的區域為蛋白質表達顯著上調區域，橫坐標小于?1且縱坐標大于1.3的區域為蛋白質表達顯著下調區域。從圖3中可以看出，13個表達上調的蛋白質中，最大表達倍數為4倍多（log24.49），而表達下調的13個蛋白質中有3個表達下調量極大，分別為0.067、0.021、0.004倍。

圖3 蛋白質表達差異顯著性的火山圖Fig.3 Volcano plot of proteins with significant differences

對26個差異表達蛋白質進行聚類分析，結果如圖4所示。這些差異表達蛋白質主要分為兩類，即表達量上調和下調。在MCL-T處理組的上調表達的蛋白質中，胞質四氫葉酸合成酶在各組中的差異較大，在下調表達的蛋白質中，熱休克蛋白HSP 90-β亞基、黃嘌呤脫氫酶和碳酸酐酶在各組中表達量差異較大。

圖4 差異表達蛋白質聚類結果Fig.4 Cluster of proteins with significant differences

通過Blast2Go（https://www.blast2go.com/）軟件對鑒定到的425種蛋白質進行基因本體（Gene ontology，GO）功能注釋，2水平注釋結果如圖5所示。從圖5中可以看出，小鼠低豐度蛋白參與了14個生理過程、具有6種分子功能、存在于7種細胞組分中。在這些生理過程中，代謝過程、細胞生成過程、多細胞組織過程、刺激應答、生理調節等過程都有10個以上差異表達蛋白；這些差異表達蛋白中，有15個具有催化活性、15個具有結合功能、6個具有分子功能調節活性；其中胞外區有21個、細胞中有13個、高分子復合物有14個、細胞器中有10個、胞外區部分有18個。

圖5 差異表達蛋白基因本體2水平統計Fig.5 GOlevel 2 statistics

對參與的生理過程、具有的分子功能和所處的細胞組分對小鼠血清低豐度表達蛋白質進行分類，再通過Fisher精確檢驗方法對小鼠血清低豐度表達的26個差異表達蛋白進行GO功能富集分析，結果如圖6和表5所示。結果表明，在小鼠血清低豐度表達蛋白質中，與ADB-M組相比，ADB-T組有5、3、2、2種顯著表達的蛋白質分別參與了細胞趨化性、凋亡過程中半胱氨酸型肽鏈內切酶活性、轉化生長因子β受體信號通路正向調節、嘌呤堿基代謝過程等4個生物過程，其富集度分別為0.227、0.333、0.667、0.667；而具有對C-N鍵（非肽鍵）作用的水解酶活性、絲氨酸水解酶活性、趨化活性等3個生物功能的蛋白質分別有10、9、2種表達顯著；存在于微管和胞漿組分中的差異表達蛋白各有3個，其富集度分別為0.6和0.375。

表5 GO功能富集度Table 5 Richfactor of enriched GOterms

圖6 差異表達蛋白GO功能富集結果Fig.6 Enriched GO termsof proteinswith significant differences

生物體內蛋白質在行使其功能時，受多方面因素調節，包括與其它蛋白質之間的協調作用。這些相互作用構成代謝通路。通過觀察大鯢活性肽治療前后蛋白質在KEGG通路中表達的變化，可以在蛋白質層面獲得大鯢活性肽對治療小鼠衰老的機理。如圖7所示，通過Fisher精確檢驗方法對差異表達蛋白質進行KEGG通路富集分析，結果表明，內分泌調節的及其它因素調節的鈣再吸收，腎素-血管緊張素系統，IL-17信號通路和壞死性凋亡等重要通路發生了顯著變化。

圖7 KEGG通路富集結果Fig.7 Enriched KEGG pathways

3 討論

衰老是多細胞生命體生長發育成熟后在遺傳、環境與生活方式等多種因素共同作用下引起生理機能逐步退行性下降的過程，小鼠衰老時表觀學上為毛色灰暗，體重增長緩慢，精神萎靡等[19]。已有文獻表明，機體衰老與體內自由基的量有關[9,13]，抗衰老活性物質一般具有清除自由基活性。具有抗衰老活性的生物活性物質可令代謝紊亂小鼠代謝趨向正常化，其體內相關抗氧化酶和還原性物質含量得到改善，例如抗氧化蛋白[25]、超氧化物歧化酶[26]等，也可以降低衰老小鼠MDA含量。

在本研究中，通過對小鼠連續6周注射D-半乳糖后，模型組與灌胃大鯢活性肽組相比，小鼠血清低豐度蛋白質表達差異的有26個，包括四氫葉酸合成酶、糖原磷酸化酶和黃嘌呤脫氫酶等蛋白質。四氫葉酸合成酶是葉酸代謝途徑中的關鍵酶，在一碳單位轉移過程起作用，主要參與核酸代謝、蛋白質與核酸的甲基化與修復反應[27]，為生物進行正常生長代謝、細胞損傷修復提供了必要的物質基礎。本研究中衰老小鼠接受大鯢活性肽后，胞質四氫葉酸合成酶表達量上調，有利于D-半乳糖致衰老小鼠恢復正常。糖原磷酸化酶是糖原分解為1-磷酸葡萄糖的限速酶，其量的增加或降低影響生物的供能、高分子化合物合成代謝重要中間化合物來源[28]。本研究中的衰老小鼠經大鯢活性肽的調理后，糖原磷酸化酶表達量上升，有利于衰老小鼠恢復血糖濃度，進入正常生長狀態。黃嘌呤脫氫酶參與嘌呤代謝，催化產生高氧化能力的過氧化物，使得機體易受氧化損傷[29?31]。灌胃大鯢活性肽后，衰老小鼠黃嘌呤脫氫酶表達量降低，在一定程度上可以減少過氧化物的含量，使得衰老小鼠臟器免受過氧化物的攻擊。因此，對D-半乳糖致衰小鼠灌胃大鯢生物活性肽，可以改善小鼠體內TAOC、SOD和MDA，并使多個代謝關鍵酶的表達量增加或減少，改善小鼠衰老狀態，因此本研究所用大鯢生物活性肽具有抗衰老活性。

4 結論

本研究通過D-半乳糖致小鼠衰老實驗，發現大鯢活性肽可以使衰老小鼠體重和脾指數恢復增加，并引起SOD和T-AOC升高，降低肝指數和MDA含量，增強機體免疫，改善衰老小鼠紊亂的生化指標。衰老小鼠血清低豐度蛋白質中胞質四氫葉酸合成酶和肌糖原磷酸化酶表達量增加，黃嘌呤脫氫酶表達量減少，這些蛋白質表達量的變化，可以降低機體中自由基，延緩衰老進程。這些結果表明，分量為1400～2000 Da的大鯢活性肽具有抗小鼠衰老作用。