缺血性腦卒中不同證候及表型與WD重復域5B基因多態(tài)性的相關性

古聯(lián) 陳卓 梁琳梅 朱路路 周文君 龍建雄 蘇莉

(廣西中醫(yī)藥大學 1第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2研究生院；3廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院)

缺血性腦卒中(IS)在中醫(yī)學中可歸屬于“中風”范疇。遺傳因素與環(huán)境因素共同作用促使發(fā)生IS，其中遺傳因素在 IS 的病變過程中起著不可或缺的作用〔1〕。IS的中醫(yī)證候是對該病某個階段或某個類型的病理概括，根據(jù)其不同臨床特點可辨證分為數(shù)個證候。研究表明組學相關研究可揭示中醫(yī)證候的內(nèi)在分子基礎，其中基因遺傳多態(tài)性可能是中醫(yī)證候的微觀生物學標志，其影響個體疾病的差異表現(xiàn)，兩者關系密切〔2〕。WD重復域(WDR)5B基因編碼含有數(shù)個WD40重復序列的蛋白質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，WD40重復序列蛋白家族在信號傳導、mRNA加工、基因表達調(diào)控、細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用〔3〕。目前發(fā)現(xiàn)多種人類疾病與該重復蛋白家族基因突變相關〔4〕。在神經(jīng)研究方面，也已報道多種WD40重復序列家族蛋白與氧化應激、細胞損傷、神經(jīng)再生相關〔5，6〕。現(xiàn)暫未見IS及其中醫(yī)證候與WDR5B基因多態(tài)性的關聯(lián)研究報告。本研究就IS各中醫(yī)證候及臨床表型與WDR5B基因rs9843165多態(tài)性的相關性進行病例-對照研究，以探討IS患者中醫(yī)證候的發(fā)生發(fā)展是否具有一定基因遺傳特征及臨床表型相關性。

1 資料與方法

1.1研究對象 本研究共納入IS患者774例，對照組793例。以廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病科(一區(qū)、二區(qū))為病例組納入點，收集兩個區(qū)2015～2019年收治的IS住院病例。選擇同時期該院及社區(qū)體檢中心的參加健康體檢者作為對照組。納入標準：病例組：①需符合中醫(yī)診斷及西醫(yī)診斷標準。中醫(yī)疾病診斷依照國家中醫(yī)藥管理局制訂的《中風病診斷與療效評定標準(試行)》中的IS的診斷標準〔7〕；西醫(yī)診斷參照第四次全國腦血管病學術會議修訂的《各類腦血管疾病診斷要點》其中的IS的診斷標準〔8〕；本研究內(nèi)IS證候診斷則采用國家中管局制定的《中風病辨證診斷標準(試行)》〔9〕。②起病均為72 h之內(nèi)的急性期IS患者。③所有患者行頭顱CT和(或)頭顱磁共振成像(MRI)+磁共振彌散成像(DWI)檢查以明確診斷。對照組：應為一般正常人，既往不存在神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史或家族史者；年齡和性別分布與本研究中的病例組有可比性。患者自我報告為中國漢族人群，研究對象之間均無血緣關系。排除標準:病例組：①短暫性腦缺血發(fā)作、腦血管畸形、血液系統(tǒng)疾病及藥物等其他因素引起的IS；②嚴重心功能不全、嚴重肝腎功能不全、合并有感染性疾病或嚴重免疫系統(tǒng)疾病的患者；③不依從者。對照組：①伴有嚴重心臟、肝臟或腎臟疾病者；②有自身免疫系統(tǒng)疾病者，或正在使用免疫抑制劑或激素者。對照組女356 例，男437例，平均年齡(63.81±10.36)歲。病例組女315例，男459例，平均年齡(64.12±10.34)歲。兩組性別構成差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.815，P=0.093)，兩組平均年齡分布差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.582，P=0.561)，具有可比性。病例組行中醫(yī)辨證，風證315例、火熱證86 例、痰證346例、血瘀證173例、氣虛證88例、陰虛陽亢證17例(各證之間有重疊)。本研究標陰虛陽亢證樣本量過少，故后續(xù)統(tǒng)計分析不計入該證候病例。

1.2研究方法

1.2.1中醫(yī)辨證標準 采用國家中醫(yī)藥管理局制定的《中風病辨證診斷標準(試行)》對IS患者進行辨證及證候賦分。該標準綜合了中醫(yī)診斷要素，如起病緩急、臨床特點、二便情況、舌脈象等，將IS精簡概括為6個具有臨床代表性的證候，包括風證、火熱證、痰證、瘀血證、氣虛證、陰虛陽亢證，同時賦分，分數(shù)≥7分則該證候診斷成立，分值越高則該證候特征越明顯。所有病例組均經(jīng)2名主治醫(yī)師以上職稱的中醫(yī)師根據(jù)前述標準四診合參進行辨證，若2名中醫(yī)醫(yī)師對同一患者的證候辨證結(jié)果不一致，即提交至副主任醫(yī)師以上職稱的中醫(yī)醫(yī)師確定證候評分。所有研究的對象知情同意并簽訂同意書。研究方案已通過廣西醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會審核同意。

1.2.2基因分型檢測 采集受試者2 ml的清晨空腹外周靜脈血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，采用血液基因組 DNA 提取試劑盒 (北京天根科技有限公司)，依說明書提取研究對象血液樣本的基因組DNA。使用1.25%瓊脂糖凝膠電泳顯示目的擴增片段后以進行DNA質(zhì)檢，同時進行OD值檢測，質(zhì)檢合格的DNA即轉(zhuǎn)移至-80℃的低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｒ镌O計及合成交由生物公司完成。第一引物序列：5′-ACGTTGGATGCCGTAACCTCACACATTAAC-3′；第二引物序列：5′-ACGTTGGATGGCGTGTTTATCATGTCTCCG-3′。利用 Sequenom 基因分型平臺對WDR5B基因rs9843165多態(tài)性位點進行基因分型檢測。

1.2.3收集指標 ①一般指標：年齡、性別、民族。②臨床指標：活化部分凝血酶原時間 (APTT)、D-二聚體(D-D)、纖維蛋白原(FIB)、國際標準化比率(INR)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶原時間活動度(PTA)、血小板(PLT)、載脂蛋白A1(apo-A)、apo-B、總膽固醇(TC)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、三酰甘油(TG)、同型半胱氨酸(Hcy)等。

1.3統(tǒng)計學方法 應用PLINK軟件進行χ2檢驗、非條件 Logistic回歸模型分析、Linear回歸分析。上述關聯(lián)分析均采用加性模型、隱性模型、顯性遺傳模型進行。采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1WDR5B基因rs9843165多態(tài)性位點的哈溫平衡檢驗及基因型頻率分布比較 對照組WDR5B基因rs9843165位點基因型頻率分布Hardyweinberg平衡(P=0.114)，本研究所涉及的樣本具有群體代表性。IS各病例證候組(風證組、火熱證組、痰證組、血瘀證組、氣虛證組)與對照組之間的基因型頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.050)。見表1。

表1 WDR5B基因rs9843165多態(tài)性位點的基因型頻率分布比較(n)

2.2WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS易感性的關聯(lián) 在校正性別年齡前，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與 IS 易感性的關聯(lián)均無統(tǒng)計學意義〔加性模型：OR(95%CI)=1.06(0.91～1.24)，P=0.459；顯性模型：OR(95%CI)=1.03(0.84～1.25)，P=0.801；隱性模型：OR(95%CI)=1.24(0.88～1.75)，P=0.226；等位基因模型：OR(95%CI)=1.06(0.91～1.23)，P=0.468〕；在校正性別年齡后，該基因多態(tài)性與IS易感性的關聯(lián)亦無統(tǒng)計學意義〔加性模型：ORadj(95%CI)=1.06(0.91～1.24)，Padj=0.431；顯性模型：ORadj(95%CI)=1.03(0.85～1.26)，Padj=0.742；隱性模型：ORadj(95%CI)=1.23(0.87～1.74)，Padj=0.236〕。

2.3WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS中醫(yī)證候發(fā)生風險的關聯(lián) 在隱性模型中(CC vs CG+GG)，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS火熱證發(fā)生風險的關聯(lián)性均有統(tǒng)計學意義〔隱性模型：OR(95%CI)= 1.93(1.02～3.67)，P=0.044〕，而與其他四個證候未見明顯關聯(lián)性，見表2；在校正年齡、性別后，該位點與火熱證的發(fā)生風險有統(tǒng)計學關聯(lián)〔隱性模型：ORadj(95%CI)=1.93(1.01～3.67)，Padj=0.046〕，見表3。

表2 WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS中醫(yī)證候發(fā)生風險的關聯(lián)

表3 WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS中醫(yī)證候發(fā)生風險在校正后的關聯(lián)

2.4WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的凝血標志物的關聯(lián)性 在加性模型中(CC vs GG)，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的D-D水平的關聯(lián)性有統(tǒng)計學意義〔加性模型：β(95%CI)=0.28(0.02～0.54)，P=0.034〕；在隱性模型(CC vs CG+GG)分析中，該位點多態(tài)性與IS患者的D-D水平顯著相關〔隱性模型：β(95%CI)=0.83(0.26～1.39)，P=0.004〕，而WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者在其他表型間的關聯(lián)無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者凝血標志物的相關分析

2.5WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的血脂水平的關聯(lián)性 對WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的血脂水平進行關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的VLDL水平的關聯(lián)性有統(tǒng)計學意義〔加性模型：β(95%CI)=-0.05(-0.10～0.00)，P=0.042〕，該位點多態(tài)性與IS患者的TG水平有統(tǒng)計學關聯(lián)〔加性模型：β(95%CI)=-0.21(-0.42～0.00)，P=0.049〕，見表5。

表5 WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者血脂水平的相關分析

2.6WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者Hcy水平的相關分析 WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者血漿Hcy水平顯著相關〔加性模型：β(95%CI)=-0.78(-1.38～-0.17)，P=0.012；隱性模型：β(95%CI)=-1.83(-3.13～-0.53)，P=0.006〕；校正性別、年齡后分析，兩者仍具有顯著關聯(lián)〔加性模型：β(95%CI)=-0.79(-1.38～-0.21)，P=0.008；隱性模型：β(95%CI)=-2.07(-3.32～-0.81)，P=0.001〕。

3 討 論

中醫(yī)診斷思維過程的核心內(nèi)容是“辨證”，所言之“證”即“證候”，是以臨床四診證據(jù)為基礎對疾病某一階段病機、病性、病位的高度概括。以此為基礎，疾病不同階段的病機病變特點則表現(xiàn)出不同的證候，可稱為“同病異證”，如IS在臨床可分為風證、火熱證、痰瘀證等數(shù)個證候。此外，在現(xiàn)代醫(yī)學中，IS根據(jù)病因特點可分為大動脈粥樣硬化型、小動脈閉塞型、心源性栓塞型等病變類型，體現(xiàn)出疾病的異質(zhì)性。可以發(fā)現(xiàn)中醫(yī)證候理論中的同病異證與現(xiàn)代醫(yī)學的疾病異質(zhì)性存在相契合點。現(xiàn)代醫(yī)學認為IS是基因和環(huán)境共同作用而發(fā)生的，不同基因通過對蛋白調(diào)控及表達，可反映出不同臨床類型，相關研究已表明臨床亞型的表現(xiàn)有分子遺傳學基礎〔10〕。相似地，有學者認為基因多態(tài)性可作為中醫(yī)證候的分子遺傳學基礎，兩者有著緊密的關聯(lián)〔2〕。吳天敏等〔11〕關于2型糖尿病的研究同樣發(fā)現(xiàn)基因遺傳多態(tài)性與中醫(yī)證候的密切聯(lián)系，該研究發(fā)現(xiàn)TCF7L2基因rs7903146多態(tài)性T等位基因可能與2型糖尿病痰熱互結(jié)證的發(fā)生相關，而與該研究其他中醫(yī)證候無明顯關聯(lián)。一項糖尿病的研究報告〔12〕，研究者對白細胞介素(IL)-6基因rs1800796多態(tài)性與高血壓中醫(yī)證型進行關聯(lián)性研究并發(fā)現(xiàn)基因與證候間存在陽性關聯(lián)，進一步研究發(fā)現(xiàn)該位點GC型可能為高血壓痰瘀互結(jié)型的風險基因型，而在其他證型間未發(fā)現(xiàn)風險關聯(lián)性。本研究結(jié)果提示該多態(tài)性位點可能作為IS火熱證的獨立風險位點。上述研究均不同程度提示中醫(yī)證候具有分子遺傳學基礎，對中醫(yī)的證候本質(zhì)研究起一定促進作用。

WD重復域(WDR)5B基因編碼WD40重復序列蛋白，該蛋白家族功能復雜、結(jié)構保守，在信號傳導、細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮重要作用〔13〕。目前已有研究發(fā)現(xiàn)〔6〕，該蛋白家族成員通過對星形膠質(zhì)細胞的氧化應激及細胞損傷在腦缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到相應作用。近期一項關于冠心病的研究〔14〕提示，WD40重復蛋白家族成員WDR35基因通過磷酸化途徑調(diào)控內(nèi)皮細胞功能最終參與動脈粥樣硬化發(fā)展過程的調(diào)控。上述研究均提示W(wǎng)D40重復序列蛋白可能通過不同途徑參與心腦血管病發(fā)生發(fā)展過程。雖本研究發(fā)現(xiàn)，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS發(fā)生風險尚無顯著關聯(lián)，但本研究發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性與IS火熱證發(fā)生風險的關聯(lián)性有統(tǒng)計學意義，提示該位點多態(tài)性可能是IS火熱證病變的影響因素。IS火熱證多出現(xiàn)于急性期，本研究病例組均為急性期IS患者，金代醫(yī)家劉河間強調(diào)火熱致病，指出火熱在IS的病變過程中的突出作用。IS火熱病邪致病與肝、心、胃等臟腑的關系緊密，IS病變之火熱起于心肝，而實于胃腸。心屬火，心陽亢盛則表現(xiàn)為火熱；肝主升發(fā)，氣機不暢則可郁而化生火熱；陽明之胃多氣多血，食入肥甘厚膩易致陽明火熱內(nèi)生。火熱為病臨床表現(xiàn)多急，火熱之邪閉塞清竅、擾亂神明，患者出現(xiàn)IS基本癥狀之外常伴舌紅或絳、苔黃或燥、神煩或易怒、氣粗或口干、脈弦數(shù)或滑數(shù)。《素問·至真要大論》言“諸熱瞀瘛，皆屬于火”及出自《素問·生氣通天論》關于怒火引發(fā)IS的說法“大怒則形氣絕，而血菀于上，使人薄厥”，均說明火熱導致IS的重要特點。

本研究發(fā)現(xiàn)WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的D-D水平的具有顯著關聯(lián)。D-D作為血栓形成及纖溶反應的標志物參與動脈粥樣硬化的進展過程中，與IS關系密切〔15〕，WDR5B基因多態(tài)性則可能通過影響D-D代謝進而參與IS病變過程中。同時本研究也發(fā)現(xiàn)WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的VLDL水平的關聯(lián)性有統(tǒng)計學意義，這可能與WD重復蛋白家族影響氧化應激有關。血脂及凝血功能的異常是IS發(fā)生及演變的風險因素，與本研究相似的是，研究發(fā)現(xiàn)MRAS多個多態(tài)性位點與IS血脂TC水平升高相關〔16〕。此外，我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)，無論在校正性別年齡前或校正性別年齡后，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性與IS患者的血漿Hcy水平均顯著相關，相關研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19基因多態(tài)性與IS的凝血功能及Hcy水平存在統(tǒng)計學關聯(lián)，提示該基因多態(tài)性可能影響IS患者的凝血功能及Hcy代謝〔17〕。Hcy參與腦缺血后損傷的過程，其介導機制包括氧化應激、血管內(nèi)皮損傷、炎癥反應等，其已被現(xiàn)代醫(yī)學研究證實是IS的危險因子之一〔18，19〕。綜上，WDR5B基因rs9843165多態(tài)性可能通過影響患者的血脂、凝血功能及Hcy水平進而影響IS的發(fā)生風險。但其具體影響機制需深入研究。