老年膝骨性關節炎患者外周血miR-155和NLRP3表達的關系

張健 焦永偉 王響 任偉亮 杜雙慶 齊立卿

(河北省中醫院骨三科，河北 石家莊 050000)

老年膝骨性關節炎(KOA)以關節軟骨損害為主要特征，常見有膝關節骨質增生、軟骨下骨硬化、疼痛等特性，可導致老年人下肢功能障礙〔1〕，影響老年人日常起居和生活質量。微小RNAs(miR)是一類新發現的調節基因，其中miR-155在造血、炎癥、免疫、腫瘤、肌肉發育及脂肪分化等功能中均發揮重要作用〔2〕，且高表達miR-155對促炎因子腫瘤壞死因子(TNF)-α生成發揮正調控作用〔3〕。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NLRP)3炎性體是一種存在于細胞胞質中的多蛋白復合物，被激活后可以活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1，進而誘導白細胞介素(IL)-1和IL-18等細胞因子生成與分泌、介導TNF-α引起的炎癥反應，調控機體炎性反應〔4〕，但miR-155、NLRP3在KOA中表達情況尚不清楚，因此本研究通過觀察miR-155、NLRP3在老年KOA患者中表達水平，并聯合TNF-α探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2018年2月至2019年8月經河北省中醫院確診治療的48例老年KOA患者作為觀察組，其中男22例，女26例，年齡60～78歲，平均年齡(70.81±6.79)歲；同期選取50例體檢健康老年人群作為對照組，其中男27例，女23例，年齡60～79歲，平均年齡(70.95±7.06)歲。兩組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。觀察組納入標準：①符合中華醫學會骨科分會《骨關節炎診治指南(2007版)》中KOA診斷標準〔5〕；②臨床資料完整。排除標準：①合并心血管系統疾病、肝臟疾病；②痛風病史；③感染及自身免疫性疾病；④長期服用補鈣藥物；⑤合并惡性腫瘤。根據磁共振成像(MRI)檢查結果進行分級，采用軟骨病變MRI分級標準即Recht標準〔6〕：Ⅰ級，軟骨分層結構消失，骨內出現局灶性低信號區，軟骨表面光滑；Ⅱ級，軟骨表面輪廓輕至中度不規則，軟骨缺損深度未及全層厚度的50%；Ⅲ級，軟骨表面輪廓中至重度不規則，軟骨缺損深度達全層厚度的50%以上，但未完全脫落；Ⅳ級，軟骨全層缺損、剝脫，軟骨下骨質暴露，有或無軟骨下骨質信號改變。其中Ⅰ級27例，Ⅱ級13例，Ⅲ級8例。本研究通過河北省中醫院倫理委員會批準。受試對象及其家屬均簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器 人TNF-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海傳秋生物科技有限公司；Hettich離心機(ROTOFIX32A)購自德祥科技有限公司；海爾-20℃冰箱(HYCD-282)購自青島海爾生物醫療股份有限公司；Wealtec PCR儀(1310001)購自北京威泰克有限公司；Quawell超微量紫外分光光度計(Q3000)購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.3樣品采集 所有受試人員空腹>8 h，均于清晨采集靜脈血5 ml，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清樣本置于Eppendrof管中，于-20℃冰箱保存。

1.4qRT-PCR測定血清中miR-155、NLRP3表達水平 從-20℃冰箱取出血清樣本，用Trizol試劑提取血清總RNA，異丙醇沉淀濃縮后，用75%酒精洗滌，干燥后加入100 μl 焦碳酸二乙酯(DEPC)水，檢測所得RNA純度及完整度。按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，于-20℃保存。反應體系共25 μl，包括SYBR Green Mix 9 μl，模板cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，無RNA酶水補足至25 μl。miR-155以U6為內參，反應程序為95 ℃ 20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，40個循環。NLPR3以β-actin為內參，反應條件為95 ℃ 5 min，94℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35個循環。引物由武漢博歐特生物科技有限公司設計并合成，引物序列。U6正向CTTAGTTGCATGCAG，反向AATCGTGTATAAGTC；miR-155正向GTCCCAATGCTGTCT，反向GGAAGTTGCATGCAT；β-actin正向GTAGTTTCGTGGATGCCACAG，反向GAGCTACGAG CTGCCTGACG；NLRP3正向CCCCGTGAGTCCCATTA，反向GACGCCCAGTCCACAT。采用2-ΔΔCt法計算血清中miR-155、NLPR3 mRNA相對表達量。

1.5ELISA法測定血清中TNF-α表達水平 從-20℃冰箱中取出血清樣本，采用ELISA法檢測血清中TNF-α表達水平，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.6統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、方差分析、LSD-t檢驗和Pearson相關分析。

2 結 果

2.1兩組血清中miR-155、NLRP3、TNF-α表達水平比較 觀察組血清中miR-155、TNF-α表達水平明顯高于對照組，NLRP3表達水平明顯低于對照組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組血清中miR-155、NLRP3、TNF-α表達水平比較

2.2老年KOA患者血清中miR-155、NLRP3、TNF-α表達的相關性 老年KOA患者血清中miR-155與NLRP3表達呈負相關(r=-0.689，P<0.05)，miR-155與TNF-α表達呈正相關(r=0.540，P<0.05)，NLRP3與TNF-α表達呈負相關(r=-0.513，P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組血清中miR-155、NLRP3、TNF-α表達的相關性

2.3不同級別老年KOA患者血清中miR-155、NLRP3、TNF-α表達水平比較 與Ⅰ級相比，Ⅱ級、Ⅲ級老年KOA患者血清中miR-155、TNF-α表達水平明顯升高，NLRP3表達水平明顯降低(P<0.05)；與

Ⅱ級相比，Ⅲ級老年KOA患者血清中miR-155、TNF-α表達水平明顯升高，NLRP3表達水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 不同級別老年KOA患者血清中miR-155、NLRP3、TNF-α表達水平比較

2.4血清中miR-155、NLRP3表達對KOA的診斷價值 受試者工作特征(ROC)曲線顯示，miR-155診斷KOA的ROC曲線下面積為0.925(95%CI：0.857～0.993)，截斷值為2.233，敏感度為89.6%，特異性為96.0%；NLRP3診斷KOA的ROC曲線下面積為0.800(95%CI：0.714～0.886)，截斷值為67.568，敏感度為79.2%，特異性為68.0%；miR-155、NLRP3聯合檢測診斷KOA的ROC曲線下面積為0.930(95%CI：0.865～0.995)，敏感度為91.7%，特異性為94.0%。見圖2。

圖2 miR-155、NLRP3診斷KOA的ROC曲線

3 討 論

近年KOA患者血液檢測指標逐漸得到重視，Kucharz等〔7〕、Attur等〔8〕認為炎性血漿脂質生物標志物前列腺素(PG)E2和15-羥基二十碳四烯酸(HETE)可識別有癥狀KOA患者，而外周血淋巴細胞(PBL)炎性轉錄組可識別出部分有癥狀KOA患者。Daghestani等〔9〕認為可溶性巨噬細胞生物標志物如可溶性血紅蛋白清道夫受體163蛋白(sCD163)和可溶性白細胞分化抗原(sCD)14可指示KOA患者炎癥表型。TNF-α被研究學者認為是調節KOA發病的重要炎癥介質，在KOA病理過程中促進軟骨基質降解和關節軟骨破壞〔10〕。王艷榮等〔11〕研究發現KOA患者滑液中TNF-α水平呈高表達，并隨著臨床分期增加其含量逐漸上升。Yang等〔12〕研究發現，痛風小鼠模型中miR-155表達升高，單鈉尿酸鹽(MSU)晶體誘發的腹膜炎小鼠中炎性細胞因子產生明顯增加，miR-155過表達導致抑制SH2區域的肌醇5'磷酸酶(SHIP)-1水平并增強促炎細胞因子，認為miR-155對于人類骨髓細胞促炎激活和抗原驅動的關節炎至關重要。Teramura等〔13〕通過尸檢發現miR-155與KOA炎癥相關，且可能導致干細胞耗竭。穆尚強等〔14〕研究發現KOA患者關節液中miR-155表達量上調≥2倍，認為其表達變化可能與KOA發病有關。本研究提示miR-155在KOA進程中呈高表達，推測miR-155高表達可能增強TNF-α等促炎細胞因子表達，加重炎癥傷害。

雖然IL-1β和IL-18在關節炎中的致炎和損傷軟骨及骨組織的作用已經被肯定，但其上游調控分子NLRP3的作用卻具爭議性。Shi等〔15〕研究發現關節間隙脂多糖(LPS)和三磷酸腺苷(ATP)增加可能通過NLRP3炎性小體促進膝骨關節炎發展，而雌二醇(E2)似乎通過雌激素受體β降低NLRP3 mRNA和蛋白水平來抑制NLRP3炎性體激活。Kim等〔16〕認為活動性類風濕關節炎患者外周血細胞中NLRP3炎性小體活性增強。另有研究者認為NLRP3在類風濕關節炎患者粒細胞中mRNA表達水平明顯低于對照組，推測其炎性小體信號通路是炎癥反應過程中的保護因子〔17〕。本研究結果表明NLRP3在KOA進程中呈低表達狀態，推測其可能在炎癥應激過程中起保護作用。

miR-155、NLRP3、TNF-α可能共同參與KOA發生發展，且三者表達均與KOA病癥程度相關。Pearson相關性分析結果表明在KOA發生發展過程中miR-155可能促進和激活TNF-α分泌，而NLRP3炎性小體抑制TNF-α表達，猜測在炎性應激反應中NLRP3發揮對機體的保護作用。ROC曲線分析結果表明miR-155、NLRP3對KOA均具有較好的診斷價值，且聯合檢測診斷價值更高。