老年骨質疏松患者血清Klotho蛋白水平及Klotho G395-A基因多態性與骨質疏松性骨折的相關性

劉菊 雷映紅 陳輝 戴朝博 王志剛 趙晟珣 李琳

(武漢市第一醫院老年病科，湖北 武漢 430022)

骨質疏松(OP)是一種以骨量減低，骨組織微結構破壞，導致骨脆性增加，易發生骨折為特點的全身性骨病。OP性骨折(OF)是OP的嚴重后果，也是老年人致殘、致死的主要原因之一。OP的發病機制十分復雜，是基因和環境共同作用的結果〔1〕。OP受到多方面因素的影響,其中遺傳因素占重要作用〔2〕。Klotho基因是與各種衰老表型相關的基因〔3〕。我們前期研究發現，klotho 基因 G395A 位點AA基因型可能是老年男性OP患者的致病基因〔4〕。本研究旨在探討老年OP患者血清Klotho蛋白水平及Klotho G395-A 基因多態性與OP的相關性。

1 對象與方法

1.1研究對象 本研究隨機納入2018年1月至12月于武漢市第一醫院老年病科住院的非OP老年患者50例為非OP組(非OP組)，OP非骨折的患者50例為OP組(OP組)，同期在武漢市第一醫院骨科住院的OP的老年患者50例為OP組(OF組)，入選對象均為髖部骨折。患者年齡均≥70歲，均排除嚴重心、腦、肝腎損害，各種惡性腫瘤、急性感染性疾病、手術、其他應激情況及近期服用影響骨代謝的藥物或患有影響骨代謝的疾病的患者。

1.2方法

1.2.1臨床資料 人體參數測量，包括體重、身高，計算體重指數(BMI)：體重(kg)/身高(m)2。研究對象空腹、穿單衣、脫鞋去帽，采用統一的工具檢測。測量收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP)，采集空腹8 h以上的肘靜脈血，用全自動生化儀(型號:Chemray 240，深圳雷杜生命科技公司)檢測糖化血紅蛋白(HBA1c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等指標。運用ELISIA試劑盒(貨號：ZC-31968，zcibio)檢測血清Klotho蛋白水平。采用雙能X線骨密度(BMD)測定儀，測定髖部T值(T-score)。

1.2.2Klotho基因啟動子G395-A 單核苷酸多態性(SNP)檢測 用 Taqman 等位基因特異性雜交分析進行SNP分型。采外周靜脈血2 ml,3.2%檸檬酸鈉抗凝,分離血漿和白細胞,以經典酚-氯仿法提取白細胞基因組,-70℃保存。

根據GENEBANK的KLOTHO基因全DNA序列設計引物，并由武漢谷歌生物科技有限公司合成。預計G-395A擴增產物片段長度為389 bp，上游引物為:TAGGGCCCGGCAGGAT，下游引物為：CCTGGAG-CGGCTTCGTC，FAM 標記探 A:CCCCAAGT-CGGGAAAAGTTGGTC，HEX 標記探針G:CCC-CCAAGTCGGGGAAAGTTGGTC。G-395A的PCR體系：總體積20 μl，上下游引物的濃度均為0.8 μmol/L，探針A和G的終濃度分別為75 nmol/L和250 nmol/L，反應條件:95℃預變性5 min，然后按95℃ 1 min、65℃ 30 s、72℃ 48 s 共40個循環，終末延伸72℃ 5 min，在熒光定量PCR儀上進行擴增。

1.2.3診斷標準 OP的診斷采用WHO(1994年)的診斷標準〔5〕：T值評分，T>-1為骨量正常，-1≤T≤-2.5為骨量減少，T<-2.5為OP，T<-2.5且伴有1處或1處以上骨折為嚴重OP。

1.3統計分析 采用SPSS20.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗、χ2檢驗、Spearman相關分析及非條件Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1臨床資料的比較 各組年齡比較，OP組與非OP組比較無明顯統計學差異(P>0.05)，而OF組明顯高于非OP組和OP組(P<0.05)；OF組男性比例明顯少于非OP組(P<0.05)，OP組和OF組BMI和LDL-C、Klotho蛋白水平較非OP組均明顯偏高(P<0.05)；OP組和OF組HBA1c較非OP組均明顯偏高(P<0.05)，OF組較OP組明顯偏高(P<0.05)；各組間SBP和DBP比較無明顯統計學差異(P≥0.05)；OP組和OF組BMD較非OP組均明顯偏低(P<0.05)，OF組較OP組明顯偏低(P<0.05)。見表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2Klotho G395-A 基因位點分布比較 OP組和OF組AA基因型及A等位基因頻率較非OP組均明顯升高(P<0.05)；OF組AA基因頻率較OP組明顯升高(P<0.05)，而A等位基因頻率無統計學差異(P>0.05)；3組間AG、GG基因型及G等位基因頻率無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 Klotho G395-A基因位點分布比較〔n(%),n=50〕

2.3Klotho蛋白水平、G395-A基因多態性與OF的相關性分析 選擇年齡、性別、BMI、收縮壓、舒張壓、HBA1c、LDL-C、 BMD、血清Klotho蛋白水平及Klotho G395-A基因型等因素與OF進行相關分析，顯示OF與年齡、性別、HBA1c及AA基因型頻率呈正相關(r=0.159、0.099、0.248、0.389，均P<0.05)，與BMD呈負相關(r=-0.209，P<0.05)；通過回歸分析校正混雜因素后，年齡、BMD、AA基因型頻率為OF的獨立相關因素(OR=1.17、1.43、1.04，均P<0.05)。

3 討 論

OP是絕經后女性和老年人常見病、多發性疾病，是一種與增齡有關的骨骼疾病。老年骨質疏松(SOP)是70歲以后發生的OP，據調查顯示，我國65歲以上人群OP患病率達到32.0%，其中男性為10.7%，女性為51.6%，城市地區為25.6%，農村地區為35.3 %〔6〕。OF是OP的嚴重階段，具有發病率及致殘致死率高、醫療花費高等特點〔7〕。

OF危險因素眾多。BMD減少是OF最重要的危險因素。而種族、年齡、性別、吸煙、低體重指數、缺乏運動、跌倒、絕經年齡、脆性骨折史和骨折家族史、藥物影響(如免疫抑制劑、干擾代謝的藥物、抗抑郁藥、抗凝藥、安眠藥等)等均為OF重要的危險因素〔8〕。OP發病機制遺傳因素占46%～62%，而后天因素占38%～54%〔9〕。Klotho基因是與壽命和各種衰老表型相關的基因，研究發現Klotho基因與動脈粥樣硬化、糖尿病、腎損傷、OP等相關〔10,11〕。本課題組前期研究〔4〕發現，klotho G395-A基因多態性與老年男性骨質疏松發病有關，AA基因型可能是老年骨質疏松的致病基因。

在不同人群其klotho基因單核苷酸多態性與骨密度有相關性，提示原發性OP的發生、發展可能與klotho基因表達異常有關。學者研究發現〔12〕，klotho G-395A 基因型與絕經狀態相關，絕經后女性GG基因型的BMD明顯低于AA基因型，但在絕經前卻無顯著關聯，提示在絕經后女性中klotho G-395A基因型是引發OP的易感基因。西班牙的一項研究〔13〕發現，在年齡33歲的中、青年人群中,FV+W基因型攜帶者的BMD明顯高于FF基因型,證實了klotho基因多態性是影響BMD的遺傳因素之一。田小春等〔14〕研究klotho G-395A 基因多態性與原發性OP的相關性過程中，還發現klotho G-395A 基因AA 等位基因型與男性老年人OP相關。

綜上，klotho G395-A基因多態性與老年OF有相關性，AA基因型可能是老年OF的易感基因，本研究為老年OF的防治提供理論基礎。