基于HIF-VEGF-Notch通路探討通脈活血湯對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用

李慧 李丹丹 吳珠 朱麗朋 李和教 王源江

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1藥劑科，海南 海口 570102；2針灸科；3神經(jīng)內(nèi)科)

局灶性腦缺血再灌注損傷(FCIRI)是顱腦機(jī)械性、溶栓性和手術(shù)性創(chuàng)傷引起的主要并發(fā)癥。相關(guān)主要非介入治療方法往往是針對(duì)急性期的血液循環(huán)障礙和神經(jīng)元毒性而采取的溶栓、抗炎抗氧化和減輕腦血腫水腫等措施控制繼發(fā)性腦損傷〔1〕。神經(jīng)元受損是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的根本原因，而促進(jìn)神經(jīng)元和相關(guān)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞再生修復(fù)才是恢復(fù)神經(jīng)功能的關(guān)鍵所在。向病灶補(bǔ)充內(nèi)源性或外源性神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)能夠幫助神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞等相關(guān)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞再生修復(fù)。鐘波等〔2〕向大鼠腦缺血部位移植NSCs取得較好治療效果。姜英虹等〔3〕研究表明，許多中藥制劑可通過不同的信號(hào)通路和途徑調(diào)節(jié)NSCs增殖分化。周勝強(qiáng)等〔4〕研究表明補(bǔ)陽還五湯能促進(jìn)大鼠NSCs增殖。通脈活血湯與補(bǔ)陽還五湯配方相似，其中丹參有類似作用，且兩者兼具補(bǔ)氣活血通絡(luò)的功效〔5〕。因此驗(yàn)證通脈活血湯是否有調(diào)控NSCs增殖分化作用，對(duì)該藥的臨床開發(fā)有一定指導(dǎo)意義。本研究以雄性SD大鼠為研究對(duì)象，線栓法構(gòu)建大鼠腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型模擬FCIRI，腹膜下注射通脈活血湯和低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α轉(zhuǎn)錄抑制劑(YC-1)干預(yù)治療，通過觀察大鼠神經(jīng)功能狀況、組織學(xué)鑒定NSCs增殖分化情況和檢測(cè)HIF-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-Notch各節(jié)點(diǎn)水平，探討通脈活血湯對(duì)FCIRI大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)SD大鼠54只，4～5月齡，體重為(230±20)g，購自海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(瓊)2017-0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(瓊)2017-0046，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：20180169，鼠房模擬晝夜交替(12 h/12 h)，溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度范圍為(55±15)%。給予充足的食物和清潔的飲水，定期更換墊料保持鼠箱干燥衛(wèi)生。

1.2藥品與試劑 曲拉通X-100(Triton-X-100)、HIF-1α轉(zhuǎn)錄抑制劑(YC-1)均購自美國Sigma-Aldrich公司，批號(hào)分別為T9284、Y1027；兔抗Sox2多克隆抗體、雞抗GFAP多克隆抗體、羊抗兔IgG H&L (Allophycocyanin)預(yù)吸附二抗、羊抗雞IgG H&L(Cy3?)預(yù)吸附二抗、兔抗HIF-1α單克隆抗體、大鼠VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、兔抗activated Notch1多隆抗體和兔抗β-actin單克隆抗體均購自英國Abcam公司，批號(hào)分別為ab97959、ab4674、ab130805、ab97145、ab179483、ab100786、ab8925、ab8227；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)BA1054。

1.3主要儀器 JR-30型恒溫鼠臺(tái)購自成都泰盟軟件有限公司；CM1950型冰凍切片機(jī)購自德國徠卡公司；CKX53型倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；PHOMO型酶標(biāo)儀購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；大鼠用腦立體定位儀、MCAO用線栓、大鼠腦模具購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；LHZW001蠕動(dòng)泵購自惠州市聯(lián)合眾為科技有限公司；eBlot?L1電轉(zhuǎn)膜儀購于南京金斯瑞生物科技有限公司；LightCycler?480 Ⅱ PCR儀購自瑞士羅氏公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1通脈活血湯配制 采用三九制藥生產(chǎn)的免煎飲片來配制通脈活血湯。配方：當(dāng)歸10 g、赤芍8 g、川芎8 g、紅花8 g、丹參10 g、元參8 g、地龍10 g、全蝎4 g、雞血藤10 g、甘草 4 g。以上藥物來自海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥房，所有藥材經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院李和教副主任藥師鑒定。將以上單味藥免煎飲片用分析天平稱取混合后溶解于1 000 ml 5%葡萄糖溶液中，配制成有效成分80 mg/ml藥液。200 ml帶有魯爾接頭的無菌注射器連接濾菌器對(duì)配制好的藥液進(jìn)行過濾分裝，4℃保存，用于腹膜下注射給藥。

1.4.2動(dòng)物分組與給藥 將54只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、抑制劑組〔2.5 mg/(kg·d)〕、通脈活血湯低劑量組〔20 mg/(kg·d)〕、通脈活血湯中劑量組〔40 mg/(kg·d)〕和通脈活血湯高劑量組〔80 mg/(kg·d)〕，每組各9只。大鼠造模成功后即開始藥物干預(yù)，每天稱重后按照體重給藥。抑制劑組腹膜下注射2.5 mg/kg YC-1/二甲基亞砜溶液，1次/d〔6〕，通脈活血湯低、中、高劑量組按照20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg腹膜下注射通脈活血湯藥液1次/d。假手術(shù)組和模型組注射2.5 ml 5%葡萄糖注射液，1次/d。連續(xù)給藥1 w后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3動(dòng)物建模 線栓法構(gòu)建大鼠MCAO模型〔7〕，模擬局灶性腦缺血。尾靜脈注射3%戊巴比妥鈉(25 mg/kg)麻醉大鼠，再將大鼠仰臥置于恒溫鼠臺(tái)上，使肛溫保持在(37±1)℃。剪開大鼠頸部皮膚，玻璃分針挑起右側(cè)頸動(dòng)脈；以頸總動(dòng)脈分支點(diǎn)為中心，對(duì)大鼠右側(cè)總頸動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈進(jìn)行近中心點(diǎn)結(jié)扎；線栓沿大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈推進(jìn)，待有明顯阻力時(shí)停止推進(jìn)，此時(shí)手術(shù)線已經(jīng)越過腦中動(dòng)脈分支點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)MCAO。保持2 h后撤出栓線，在近中心點(diǎn)位置結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，縫合傷口，完成造模。假手術(shù)組只在近中心點(diǎn)位置結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，不進(jìn)行MCAO。

1.4.4大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 藥物干預(yù)結(jié)束后首先進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)試。評(píng)分采用改進(jìn)自5分法〔8〕：0≤分?jǐn)?shù)<1為正常狀態(tài)；1≤分?jǐn)?shù)<2為輕度損傷，拽尾拖曳反抗時(shí)左前肢伸展無力；2≤分?jǐn)?shù)<3為中度損傷，左側(cè)跛行無法或直行障礙；3≤分?jǐn)?shù)<4為重度損傷，站立不穩(wěn)易向左側(cè)傾倒；4≤分?jǐn)?shù)<5為嚴(yán)重?fù)p傷，不能行走，意識(shí)不清醒。

1.4.5樣本采集 對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后，將大鼠麻醉后固定在腦立體定位儀上，剪開寰枕處皮膚，灰色頭皮針穿入枕大池，微量進(jìn)樣器抽取腦脊液100 μl，注入EP管-20℃凍存用于ELISA檢測(cè)。采集后回輸100 μl生理鹽水用于維持顱內(nèi)壓，縫合傷口，用于下一步采集。然后各組隨機(jī)取3只大鼠用于免疫組織化學(xué)染色，其余用于RT-PCR和Western印跡檢測(cè)。

用于免疫組化的大鼠麻醉后仰臥用解剖針固定四肢于蠟盤上，沿體中線剪開胸腹腔，眼科剪剪開心包膜暴露出心臟。將灌流針穿入左心室，同時(shí)剪開靠近右心房的體靜脈，先以40 ml/min流速灌入200 ml 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH為7.4)，再以20 ml/min灌入200 ml 4℃ 4%多聚甲醛溶液。開顱取腦，借助腦模具冠狀截取A 1.25至A 1.5之間右腦組織塊，置于4%多聚甲醛4℃固定24 h，0.02 mol/L PBS漂洗3次，沖掉固定液以防止脫片。最后4℃下依次在12.5%和25.0%的蔗糖溶液中沉糖脫水，以備切片。

用于RT-PCR和Western印跡檢測(cè)的大鼠，斷頸處死取右腦側(cè)端腦進(jìn)行低溫勻漿，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.6免疫熒光雙重標(biāo)記染色檢測(cè)大鼠腦組織中Sox2和GFAP染色細(xì)胞數(shù) 從蔗糖溶液中取出腦組織塊進(jìn)行冠狀冰凍切片(樣品頭-22℃，切片室-19℃，切片厚度30 μm)。將切片用PBS沖洗后使用0.1%曲拉通打孔，PBS沖洗，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min，甩掉封閉液，加一抗(稀釋比例均為1∶100)4℃過夜后，加PBS在脫色搖床上洗掉未附著一抗，滴加熒光二抗孵育1 h，PBS洗去未附著二抗，然后用抗淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視場(chǎng)拍照。采用ImageJ15.1軟件進(jìn)行分析。將圖像變?yōu)?6位灰度圖像后，對(duì)發(fā)熒光部分進(jìn)行閾值填充，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)工具對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.7RT-PCR檢測(cè)大鼠腦組織HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平 取0.5 g組織勻漿，加入核酸提取液富集總RNA，260/280法確定RNA豐度符合PCR要求后，使用cDNA試劑盒在RT-PCR儀上合成cDNA。參比為GADPH，采用2-ΔΔCq法計(jì)算mRNA含量。引物合成服務(wù)由上海生工生物工程股份有限公司提供。HIF-1：正向序列：5′-TGA ACA TCA AGT CAG CAA CG-3′,反向序列：5′-CAC AAA TCA GCA CCA AGC AC-3′;VEGF：正向序列：5′-GAA GCT CAT CTC TCC TAT GTG CTG GC-3′,反向序列：5′-GAA GCT CAT CTC TCC TAT GTG CTG GC-3′;Notch1：正向序列：5′-GAC CGT GTG GCT TCC TTC TA-3′,反向序列：5′-GTT GGT GTC GCA GTT GGA G-3′;GADPH：正向序列：5′-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′,反向序列：5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′。

1.4.8ELISA測(cè)定大鼠腦脊液中VEGF含量 將腦脊液樣本和ELISA試劑盒室溫平衡20 min。校準(zhǔn)品復(fù)孔。參考說明書，加注樣品稀釋液后每孔加入校準(zhǔn)品或樣品25 μm，微孔板振蕩器快速振蕩2～3 s貼封板膜37℃溫箱孵育，洗板3次，拍干后加入酶標(biāo)抗體孵育，再洗板拍干，加入TMB室溫顯色5 min后加入終止液終止顯色。顯色過程控制本底。酶標(biāo)儀450 nm下測(cè)各孔吸光度。獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線后，反推樣本VEGF濃度。

1.4.9Western印跡檢測(cè)大鼠腦組織中HIF-1α、Notch1蛋白表達(dá)量 向1.4.5剩余組織勻漿中加入蛋白提取液，冰塊上靜置1 h。4℃ 8 000 r/min離心15 min，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白富集程度。之后進(jìn)行電泳轉(zhuǎn)膜。BSA封閉后，加入一抗二抗孵育。ECL顯色后，使用凝膠成像儀拍照，分析各組蛋白表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS2.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 與假手術(shù)組神經(jīng)功能評(píng)分〔(0.00±0.00)分〕相比，模型組〔(4.32±0.13)分〕顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組〔(3.44±0.27)分〕、通脈活血湯低、中、高劑量組〔(3.92±0.13)、(3.75±0.18)、(3.51±0.20)分〕神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.05)，且通脈活血湯各組隨著劑量的升高神經(jīng)功能評(píng)分依次降低(P<0.05)；與抑制劑組相比，通脈活血湯低、中劑量組神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.05)，通脈活血湯高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2免疫熒光雙重標(biāo)記染色檢測(cè)大鼠腦組織中Sox2、GFAP染色細(xì)胞數(shù) 與假手術(shù)組相比，模型組Sox2、GFAP染色細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組、通脈活血湯低、中、高劑量組Sox2、GFAP染色細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，且通脈活血湯各組隨著劑量的升高Sox2、GFAP染色細(xì)胞數(shù)依次升高(P<0.05)；與抑制劑組相比，通脈活血湯低、中劑量組Sox2、GFAP染色細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，通脈活血湯高劑量組Sox2、GFAP染色細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表1。

Sox2染色細(xì)胞在630 nm激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光，GFAP染色(Cy3)細(xì)胞在552 nm激發(fā)光下發(fā)綠色熒光，Sox2與GFAP重疊發(fā)黃色熒光圖1 各組腦組織Sox2、GFAP免疫組化染色(×50)

表1 各組腦組織Sox2、GFAP染色細(xì)胞數(shù)

2.3RT-PCR檢測(cè)大鼠腦組織中HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平 與假手術(shù)組相比，模型組腦組織HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組、通脈活血湯低、中、高劑量組腦組織HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，且通脈活血湯各組隨著劑量的升高HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平依次降低(P<0.05)；與抑制劑組相比，通脈活血湯低、中劑量組腦組織HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，通脈活血湯高劑量組腦組織HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組腦組織HIF-1、VEGF、Notch1 mRNA及HIF-1α、Notch1蛋白表達(dá)水平比較

2.4ELISA檢測(cè)腦脊液VEGF水平 與假手術(shù)組腦脊液中VEGF水平〔(5.21±0.21)pg/ml〕相比，模型組〔(15.15±3.14)pg/ml〕顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組〔(8.25±1.31)pg/ml〕、通脈活血湯低、中、高劑量組〔(12.45±2.12)、(9.52±1.21)、(7.44±1.18)pg/ml〕顯著降低(P<0.05)，且通脈活血湯各組隨著劑量的升高腦脊液中VEGF水平依次降低(P<0.05)；與抑制劑組相比，通脈活血湯低、中劑量組腦脊液中VEGF水平顯著升高(P<0.05)，通脈活血湯高劑量組腦脊液中VEGF水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5Western印跡檢測(cè)大鼠腦組織中HIF-1α、Notch1蛋白水平 與假手術(shù)組相比，模型組HIF-1α、Notch1蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，抑制劑組、通脈活血湯低、中、高劑量組HIF-1α、Notch1蛋白水平顯著降低(P<0.05)，且通脈活血湯各組隨著劑量的升高HIF-1α、Notch1蛋白水平依次降低(P<0.05)；與抑制劑組相比，通脈活血湯低、中劑量組HIF-1α、Notch1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，通脈活血湯高劑量組HIF-1α、Notch1蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖2。

1～6:假手術(shù)組，模型組，抑制劑組，通脈活血湯低劑量組，通脈活血湯中劑量組，通脈活血湯高劑量組圖2 各組腦組織HIF-1α、Notch1 Western印跡條帶比較

3 討 論

HIF-1是組織應(yīng)對(duì)低氧最先表達(dá)的一種因子，由α和β兩種亞基組成，其中前者決定HIF-1轉(zhuǎn)錄活性。HIF-1α能夠與VEGF分子中的缺氧反應(yīng)部件特異性結(jié)合，增加其穩(wěn)定性，從而正向調(diào)節(jié)VEGF的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Notch蛋白家族是一類進(jìn)化上高度保守跨膜蛋白。VEGF與其受體結(jié)合后，引起Notch信號(hào)通路配體的表達(dá)〔9〕。Notch發(fā)揮作用時(shí)，與胞外相應(yīng)配體結(jié)合后會(huì)水解釋放胞內(nèi)部分，Notch胞內(nèi)部分能夠進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，影響細(xì)胞形態(tài)發(fā)生。腦缺血再灌注等極端條件下，組織細(xì)胞中HIF-1α病理性高表達(dá)從而引起VEGF和Notch1的異常升高，這種病理性的升高可能并不利于神經(jīng)功能的保護(hù)。Sun等〔10〕研究指出miRNA-210激活HIF-1α-VEGF途徑會(huì)導(dǎo)致大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。Wang等〔11〕指出HIF-1α升高可通過HIF-VEGF途徑影響水通道蛋白4活性從而加重腦水腫和血腦屏障破壞。有研究指出HIF-1α病理性升高能影響核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB炎癥通路從而加重細(xì)胞凋亡〔12〕。促進(jìn)VEGF升高雖然有利于新血管生成、對(duì)腦血管內(nèi)皮保護(hù)作用，但VEGF病理性高表達(dá)容易誘導(dǎo)生成不成熟、易滲漏的微血管，其滲出物反而會(huì)進(jìn)一步加重周圍正常神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)〔13,14〕。Herrick等〔15〕研究表明Notch1高表達(dá)會(huì)使NSCs保持休眠。Contreras等〔16〕研究表示果蠅視葉NSCs中Notch1異常高表達(dá)會(huì)使其向祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化。急性期減弱Notch信號(hào)通路能促進(jìn)NSCs增殖、向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等分化，從而有利于神經(jīng)修復(fù)〔17〕。Hao等〔18〕指出在腦卒中亞急性期抑制Notch1可促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生和軸突重組。在一定程度上調(diào)Notch有利于NSCs增殖，但Notch1病理性升高可能會(huì)使Notch趨于休眠保護(hù)狀態(tài)，不利于NSCs增殖。因此在下調(diào)病理狀態(tài)下的HIF-VEGF-Notch通路可誘導(dǎo)NSCs增殖分化，從而起到神經(jīng)保護(hù)的作用。Sox2是NSCs特異性標(biāo)志物，而GFAP則在星形膠質(zhì)細(xì)胞和NSCs細(xì)胞中表達(dá)。因此可以通過Sox2和GFAP熒光雙標(biāo)染色來觀察大鼠腦組織中NSCs增殖和分化情況〔19〕。中醫(yī)認(rèn)為FCIRI屬于“風(fēng)、火、痰、瘀”，血瘀內(nèi)停，痹阻腦絡(luò)，腦失所養(yǎng)，筋脈失于濡養(yǎng)而發(fā)病。本研究所用通脈活血湯中當(dāng)歸、丹參、川芎、雞血能夠補(bǔ)血化瘀、行氣通滯的功效，其余各藥也均有通經(jīng)活絡(luò)的作用，對(duì)癥下藥以解諸癥。

本研究顯示，抑制劑組神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織中Notch1、VEGF和HIF-1 mRNA水平、腦脊液中VEGF水平、腦組織中HIF-1α和Notch1蛋白水平比模型組和通脈活血湯低、中劑量組低，這可能是因?yàn)閅C-1特異性地抑制HIF-1α，從而下調(diào)VEGF和Notch1水平。Na等〔20〕研究結(jié)果表明YC-1有抑制反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)保護(hù)的作用。Shen等〔21〕也指出YC-1通過抑制HIF-1α與MMP-2和VEGF相互作用，降低血腦屏障損傷。本研究結(jié)果說明高劑量的通脈活血湯有YC-1樣作用，推測(cè)通脈活血湯也可能通過其他調(diào)節(jié)通路進(jìn)一步促進(jìn)NSCs增殖分化。

綜上，在MCAO大鼠治療過程中，通脈活血湯可能通過影響HIF-VEGF-Notch通路，改善病理性NSCs休眠，來促進(jìn)NSCs增殖分化，從而起到神經(jīng)保護(hù)的作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)沒有對(duì)HIF-VEGF-Notch下游Notch1信號(hào)途徑的多樣性展開進(jìn)一步探討是本研究的不足之處。