補陽還五湯對腦出血大鼠腦組織HIF-1α、SDF-1、CXCR-4表達的影響

畢紅東 江思瑜 李寶群 苗光新 吳曉光

(承德醫學院，河北 承德 067000)

腦出血是指非外傷性腦實質出血，目前治療的主要入手點為防止占位效應和進一步出血的擴展(如急性溶栓或手術移除血腫等)〔1〕，但是患者的治療效果不盡人意，嚴重威脅人類健康，故轉變治療方向意義重大。近年來，隨著對腦出血機制的進一步研究，有學者〔2〕提出提高腦出血患者的神經細胞存活度、穩定神經細胞功能或可能成為治療腦出血的新入手點。補陽還五湯方劑由清代名醫王清任始創，是補氣活血的良方，具有益氣活血通絡之功效，在促進神經功能恢復、拮抗腦損傷方面具有一定作用，能夠有效治療半身不遂等病癥，分析其作用機制可能與抗血栓、抑制細胞凋亡、減輕鈣超載和抗氧化應激及促進神經營養因子表達等多個方面〔3,4〕有關。自噬作為一種決定細胞存活和死亡的新機制在腦出血損傷中扮演重要作用，但尚無補陽還五湯對自噬相關蛋白缺氧誘導因子(HIF)-1α、基質細胞衍生因子(SDF)-1α、趨化因子受體(CXCR)4及其下游通路的研究。本研究主要觀察補陽還五湯對腦出血大鼠腦組織內HIF-1α、SDF-1、CXCR4表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級，雄性，SD大鼠，體重280～320 g(北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號SCXK(京)2012-0001)。

1.2藥物及試劑 補陽還五湯(黃芪120 g、當歸尾6 g、赤芍4.5 g、川芎4.5 g、干地龍3 g、桃仁3 g、紅花3 g)購自北京同仁堂承德分公司；銀杏葉片(煙臺榮昌制藥有限公司，批號140404)。HIF-1α兔抗多克隆抗體(Bioworlde，BS3514)，SDF-1α、CXCR4兔抗大鼠多克隆免疫組化試劑盒，Beclin-1一抗，TUNEL凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為BA1389、BA0761、PB0014、MK1024)。

1.3儀器 雙臂數顯腦立體定位系統(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，BWSSa907型柔性骨鉆(上海軟隆科技發展有限公司)，AHB-LB-2型萬能研究顯微鏡(德國萊卡公司)，Ti-u型熒光顯微鏡(日本尼康公司)，DYCP-35型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.4動物模型制備及分組給藥 72只大鼠隨機等分為：假手術組、模型組、補陽還五湯組和銀杏葉片組。其中模型組、補陽還五湯組、銀杏葉片組腦出血大鼠模型采用改良Rosenberg法〔5〕法制備：10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，大鼠頂正中行矢狀切口，剝離軟組織及筋膜，暴露前囟點和矢狀縫。在位于前囟點前2.0 mm，矢狀縫右側旁開3.0 mm處用三棱針鉆一直徑大約為1.0 mm的小孔。借助立體定向儀利用微量注射器沿鉆孔垂直進針6.0 mm，注入大鼠自體動脈血80 μl，留針10 min后緩慢拔針，碘伏消毒手術區后，縫合切口。假手術組僅顱骨鉆孔，進針，不注射任何物質。術后24 h，補陽還五湯組、銀杏葉片組的大鼠分別灌胃給予26 g/(kg·d)和3.5 mg/(kg·d)，每日1次，共14 d，假手術組及模型組相應灌胃給予等量生理鹽水。

1.5蛋白表達及細胞凋亡檢測 在末次給藥1 h后，大鼠斷頭取視交叉至大腦橫列腦組織，10%甲醛固定48 h，常規石蠟包埋，5 μm厚冠狀切片，利用免疫組化法檢測HIF-1α、SDF-1α、CXCR-4蛋白的表達變化。采用Western印跡法來檢測Beclin-1蛋白的表達變化。采用TUNEL法檢測細胞凋亡的變化。

1.6統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1HIF-1α陽性細胞表達變化 與假手術組比較，模型組腦組織內HIF-1α蛋白的表達明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯組、銀杏葉片組的大鼠腦組織HIF-1α蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 補陽還五湯對腦出血大鼠腦組織 HIF-1α、Beclin-1表達及TUNEL陽性細胞數的影響

圖1 補陽還五湯對腦出血大鼠HIF-1α蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

2.2細胞凋亡數量的變化 TUNEL陽性表達為呈棕黃色顆粒，位于細胞核。與假手術組比較，模型組血腫周圍皮質TUNEL陽性細胞顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯組和銀杏葉片組腦組織TUNEL陽性表達顯著減少(P<0.05)。見表1。

2.3Beclin-1的變化 與假手術組比較，模型組的Beclin-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯組、銀杏葉片組的Beclin-1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。 見表1。

2.4SDF-1α、CXCR4陽性細胞表達變化 模型組、補陽還五湯組及銀杏葉片組SDF-1α、CXCR4陽性細胞數均顯著高于假手術組，且補陽還五湯組及銀杏葉片組陽性細胞數目高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 補陽還五湯對大鼠腦出血后SDF-1α、CXCR4陽性細胞數的影響個/視野)

3 討 論

中醫方面將腦出血歸于“中風”范疇，病機關鍵為元氣不足、瘀血阻絡，能夠對患者預后造成影響的主要因素為治療方式的選擇與腦損傷的程度。腦卒中患者損傷的神經細胞中都出現了明顯的自噬現象，這提示自噬激活或是腦缺血損傷早期的一種潛在保護機制；另外，在對大腦出現缺血情況大鼠進行預處理以后，大鼠腦組織的梗死面積顯著減少，提示腦組織發生缺血以后神經元細胞的自噬過程能夠被誘導，進而啟動細胞自身的降解過程〔6〕。本研究結果提示補陽還五湯可通過抑制細胞的凋亡改善腦出血狀態。

HIF-1是一種異源二聚體的DNA結合蛋白，其中α亞基定位于胞質并在細胞缺氧時濃度升高，而β亞基定位于胞核且濃度穩定〔7〕。腦組織受內、外力影響而出現阻塞或是破裂時將引起HIF-1α的表達升高，陳錦艷等〔8〕發現在腦出血大鼠模型中HIF-1α水平的升高，其原因可能與腦出血后造成局部腦組織缺血缺氧。本研究結果驗證了HIF-1α參與腦出血損傷這一觀點。有學者〔9〕證實了HIF-1α參與了小膠質細胞的自噬與凋亡。自噬過度能夠加重神經細胞的損傷，3-甲基腺嘌呤(MA)是一種自噬抑制劑，能夠加速神經功能的恢復并減小梗死灶的面積；也有學者證實使用含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)抑制劑(一種廣譜的抗凋亡藥物)治療減輕腦缺血所致腦損傷程度卻相當有限〔10〕，于是人們把目光逐漸轉向了自噬。自噬是哺乳動物中自身降解清除、細胞分化重建及調節自身穩態的重要手段，在自噬的過程中有眾多的基因參與了自噬的關鍵過程，其中作為ATG6同系物之一的Beclin-1目前是檢測自噬活動的標記蛋白〔11〕，Beclin-1可以調控凋亡相關蛋白磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的表達而參與自噬。本研究提示補陽還五湯能夠調控HIF-1α表達進而降低Beclin-1蛋白，抑制細胞的自噬。SDF-1α亞型高表達在腦和骨髓等器官中；CXCR4為SDF-1的G蛋白耦聯特異性受體，與SDF-1α特異結合后形成SDF-1α/CXCR4軸可以介導炎癥反應等。SDF-1α/CXCR4軸可調控血管生成，增加缺氧耐力等機制抑制細胞凋亡發揮修復神經和腦保護作用〔12，13〕，故SDF-1α/CXCR4軸亦可能對細胞自噬狀態產生調控。

綜上所述，補陽還五湯對腦出血大鼠腦組織具有保護作用，其機制與HIF-1α調控SDF-1α/CXCR4軸抑制細胞自噬有關。