DLEU2下調miR-374a-5p對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

金浩 余佳 王梓瑜 喬鷗 王軍 韓江 李兆連

(1云南省第一人民醫院(昆明理工大學附屬醫院)普通外科，云南 昆明 650032；2武漢大學人民醫院肝膽外科)

肝癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，病死率高〔1〕。治療仍然采用外科手術為主的綜合治療方式，化學治療、放射治療等多元化治療也取得了較大進展〔2〕。隨著醫學的不斷發展，靶向治療已成為肝癌治療的新途徑，靶向藥物的出現給肝癌患者帶來了新希望〔3〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是基因調控的重要組成部分，在表觀遺傳水平和轉錄中發揮重要的調控作用，研究發現，LncRNA參與肝癌的發生發展、預后治療等過程〔4〕。DLEU2在宮頸癌中低表達，過表達DLEU2能抑制宮頸癌細胞Hela和Caski的增殖、遷移和侵襲〔5〕。DLEU2通過miR-16-1影響喉癌細胞的增殖，遷移和侵襲〔6〕。而DLEU2對肝癌的影響未見報道。LncRNA作為內源競爭RNA(ceRNA)調控miRNA豐富了肝癌的發生發展機制〔7〕。近年來研究發現，體內特定miRNA的表達能抑制腫瘤細胞增殖、轉移及復發〔8〕。miR-374在肝癌細胞中上調表達〔9〕；miR-374a高表達能促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔10〕。本文旨在研究DLEU2對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及其與miR-374a-5p的調控機制，為肝癌的早期診斷和治療提供新靶點和新方法。

1 材料與方法

1.1材料 肝癌細胞HepG2、BEL-7402和正常肝細胞HL-7702購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Sigma公司；Trizol試劑、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、電化學發光(ECL)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；Transwell小室、基質膠購于美國BD公司；RIPA蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2細胞培養 肝癌細胞HepG2、BEL-7402和正常肝細胞HL-7702使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養，每天換液1次，待細胞融和至60%～70%時，加入胰蛋白酶進行消化傳代。選取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.3細胞轉染與分組 取常規培養的肝癌細胞HepG2用0.25%胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，待細胞生長至80%融合，更換為無血清培養基同步化12 h，隨后進行轉染。轉染分為miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-374a-5p組(轉染miR-374a-5p mimics)、pcDNA3.1組(轉染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-DLEU2組(轉染pcDNA3.1-DLEU2)、si-NC組(轉染si-NC)、si-DLEU2組(轉染si-DLEU2)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、anti-miR-374a-5p組(轉染anti-miR-374a-5p)、miR-NC+WT-DLEU2組(共轉染miR-NC和WT-DLEU2)、miR-NC+MUT-DLEU2組(共轉染miR-NC和MUT-DLEU2)、miR-374a-5p+WT-DLEU2組(共轉染miR-374a-5p和WT-DLEU2、miR-374a-5p+MUT-DLEU2組(共轉染miR-374a-5p和MUT-DLEU2)、pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組(共轉染pcDNA3.1-DLEU2和miR-NC)、pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組(共轉染pcDNA3.1-DLEU2和miR-374a-5p)，轉染按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

1.4MTT檢測細胞增殖 在各組細胞培養至24、48、72 h時加入20 μl(5 g/L)MTT溶液，繼續孵育4 h；棄去多余培養基并加入150 μl DMSO振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞增殖活力=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.5Transwell檢測細胞遷移和侵襲 各組細胞胰酶消化后使用無血清培養基重懸細胞，調整濃度為2×104個/ml。細胞遷移實驗：取200 μl細胞懸液接種于Transwell小室上室中，并置于含完全培養基的下室中，37℃、5% CO2條件下培養24 h，取出小室，去除培養基后用棉簽輕輕擦去上層細胞，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并隨機選取6個視野拍照，計算結晶紫染色細胞數即為遷移細胞數。細胞侵襲實驗：以1∶5比例加入RPMI1640培養液稀釋Matrigel后，鋪于Transwell小室的上室，室溫下干燥后，按照細胞遷移實驗步驟操作。最后顯微鏡下觀察結晶紫染色細胞數即為侵襲細胞數。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，離心收集各組細胞，PBS漂洗2次，加結合緩沖液重懸細胞。依據試劑盒說明書，先后加入膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)避光孵育。流式細胞儀檢測激發波長488 nm和發射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復3次。

1.7qRT-PCR檢測miR-374a-5p和DLEU2 mRNA表達水平 收集各組細胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，以β-actin為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.8Western印跡檢測 收集各組細胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，10 340 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復3次。

1.9熒光素酶報告基因檢測實驗檢測DLEU2對miR-374a-5p的靶向調控 TargetScan數據庫顯示DLEU2 3′UTR區域有miR-374a-5p結合位點。構建野生型和突變型基因靶點DLEU2的3′UTR-熒光素酶表達載體(WT-DLEU2和MUT-DLEU2)，取對數生長期肝癌HepG2細胞接種于24孔板(5×104個/孔)，待細胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000將WT-DLEU2和MUT-DLEU2組細胞分別轉染miR-NC和miR-374a-5p。依據說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統計學分析，實驗重復3次。

1.10統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1DLEU2在肝癌細胞HepG2、BEL-7402和正常肝細胞HL-7702中的表達 qRT-PCR檢測結果顯示，與HL-7702組(1.33±0.13)相比，HepG2、BEL-7402組細胞中DLEU2 mRNA的表達水平(0.38±0.11、0.76±0.15)顯著降低，3組比較差異有統計學意義(F=79.911，P=0.000)。

2.2DLEU2過表達對肝癌細胞HepG2增殖、凋亡的影響 Western印跡檢測結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細胞中Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測結果顯示，在轉染pcDNA3.1-DLEU2后，分別于24、48、72 h時檢測細胞增殖，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細胞活性顯著降低(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，相較于pcDNA3.1組，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1，圖2。

圖1 DLEU2過表達對肝癌細胞HepG2、BEL-7402凋亡的影響

圖2 DLEU2過表達對凋亡蛋白表達的影響

表1 過表達DLEU2對細胞HepG2增殖、凋亡的影響

2.3DLEU2過表達對肝癌細胞HepG2的遷移、侵襲的影響 Western印跡檢測結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細胞中N-cadherin蛋白表達水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細胞遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)。見圖3、圖4、表2。

圖3 DLEU2過表達對肝癌細胞HepG2的遷移、侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

圖4 Western印跡檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

表2 DLEU2對細胞HepG2遷移、侵襲的影響

2.4DLEU2靶向調控miR-374a-5p 通過TargetScan數據庫預測到DLEU2與miR-374a-5p存在結合位點(圖5)。熒光素酶報告基因檢測實驗結果顯示，轉染野生型DLEU2基因表達載體WT-DLEU2后，相較于miR-NC組，miR-374a-5p組WT-DLEU2肝癌細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉染突變型DLEU2基因表達載體MUT-DLEU2后，相較于miR-NC組，miR-374a-5p組MUT-DLEU2肝癌細胞的熒光素酶活性差異不無統計學意義(P>0.05)，見表3。qRT-PCR檢測結果顯示，相較于pcDNA組(0.88±0.08)，pcDNA-DLEU2組肝癌細胞中miR-374a-5p的表達水平(0.13±0.01)顯著降低(P<0.05)；相較于si-NC組(0.83±0.08)，si-DLEU2組(1.47±0.15)顯著升高(P<0.05)。

表3 雙熒光素酶報告實驗

圖5 DLEU2中含有miR-374a-5p的互補核苷酸序列

2.5抑制miR-374a-5p對肝癌細胞HepG2增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，與 anti-miR-NC組相比，anti-miR-374a-5p組細胞中miR-374a-5p的表達水平顯著降低(P<0.05)；Western印跡檢測結果顯示，與 anti-miR-NC組相比，anti-miR-374a-5p組HepG2細胞中Bcl-2、N-cadherin蛋白的表達水平顯著降低，Bax、E-cadherin蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖6，表4。

表4 抑制miR-374a-5p對凋亡、遷移、侵襲蛋白表達的影響

圖6 抑制miR-374a-5p對細胞HepG2凋亡、遷移相關蛋白的表達

MTT法檢測結果顯示，與 anti-miR-NC組相比，anti-miR-374a-5p組HepG2細胞活性顯著降低(P<0.05)。Transwell 法檢測結果顯示，與 anti-miR-NC組相比，anti-miR-374a-5p組HepG2細胞遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，與 anti-miR-NC組相比，anti-miR-374a-5p組HepG2細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 抑制miR-374a-5p對肝癌細胞HepG2增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

2.6過表達miR-374a-5p能逆轉DLEU2對肝癌細胞HepG2增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用 qRT-PCR檢測結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組細胞中miR-374a-5p的表達水平顯著降低；與pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組顯著升高(P<0.05)。Western印跡檢測結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細胞中Bcl-2、N-cadherin蛋白的表達水平顯著降低，與pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組細胞中Bax、E-cadherin蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖7，表6。

表6 miR-374a-5p過表達對細胞HepG2中凋亡、侵襲蛋白表達的影響

MTT法檢測結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細胞活性顯著降低；與pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組細胞活性顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細胞遷移和侵襲數量顯著降低；與pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組細胞遷移和侵襲數量顯著升高(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組HepG2細胞的凋亡率顯著升高；與pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組相比，pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組顯著降低(P<0.05)。見表7。

1～4：pcDNA3.1組、pcDNA3.1-DLEU2組、pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組、pcDNA3.1-DLEU2+miR-374a-5p組圖7 過表達miR-374a-5p對凋亡、遷移相關蛋白表達的影響

表7 過表達miR-374a-5p能夠逆轉DLEU2對細胞HepG2增殖、凋亡的作用

3 討 論

傳統的手術治療對早期肝癌有一定療效，但仍存在癌癥的復發、轉移和耐藥等問題，而靶向治療可以降低或消除這些情況〔11〕。尋找影響肝癌發生發展及預后的腫瘤分子靶標和作用機制，對于肝癌早期診斷及術后患者長期生存有重要作用〔12〕。LncRNA的分子調控機制比較復雜，隨著在肝癌中的研究，其在肝癌中占據越來越重要的作用〔13〕。DLEU2位于慢性淋巴細胞白血病的13q14刪除基因座上〔14〕；DLEU2通過miR-15a/miR-16-1負調節G1細胞周期蛋白E1和D1進而抑制細胞增殖，抑制腫瘤細胞系集落形成〔15〕；DLEU2可提高miR-15a/miR-16-1的表達治療慢性淋巴細胞白血病〔16〕。組蛋白去乙酰化酶抑制劑在非小細胞肺癌中通過HDAC3增加Dleu2/miR-15a/16-1的表達〔17〕。DLEU2還影響宮頸癌〔5〕、喉癌〔6〕的發展過程。但還未見DLEU2在肝癌中的相關研究，本研究結果表明，DLEU2在肝癌細胞中低表達，過表達DLEU2可抑制肝癌HepG2細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡；還能抑制Bcl-2、N-cadherin蛋白的表達，促進Bax、E-cadherin蛋白的表達。DLEU2可靶向調控miR-374a-5p的表達。

miR-374參與了多種疾病的進展，研究發現，miR-374a-5p是肥胖炎癥過程的一種潛在調節劑〔18〕。上調miR-374b-5p可通過抑制RECK表達促進胃癌細胞轉移和侵襲〔19〕。miR-374b-5p在胰腺癌組織中顯著低表達，上調miR-374b-5p通過下調多種抗凋亡蛋白減弱了胰腺癌的化療耐藥性〔20〕。miR-374a-5p在骨肉瘤患者中的表達顯著升高，作為骨肉瘤的潛在無創生物標志物〔21〕。miR-374a在膀胱尿路上皮癌患者中上調表達〔22〕；miR-374a-5p在乳腺癌〔23〕、肺癌〔24〕中上調表達。miR-374-5p下調可抑制雄性大鼠生長板軟骨細胞增殖并促進肥大分化〔25〕。miR-374a-5p低表達有利于結腸癌患者的存活〔26〕。蛋白激酶C抑制劑GF109203X可誘導體外人表皮細胞去分化，上調miR-374a-5p的表達〔27〕。本研究結果表明，抑制表達miR-374a-5p可抑制HepG2細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡；過表達miR-374a-5p能逆轉DLEU2對肝癌細胞HepG2增殖、遷移、侵襲的抑制和凋亡的促進作用。

綜上，LncRNA DLEU2可抑制肝癌細胞HepG2的增殖、遷移和侵襲，促進其凋亡，其機制可能與靶向miR-374a-5p基因有關，將可為肝癌的早期診斷預防、治療和預后提供新靶點。