miR-221在急性心肌梗死大鼠心肌損傷中的作用及機制

郝星 龍仙萍 王正龍

(遵義醫學院附屬醫院心內科，貴州 遵義 563000)

急性心肌梗死(AMI)是一種因心肌極度缺血導致的急性血栓類疾病，以致最終發生血管閉塞的心血管疾病。AMI常發于老年人，發病率及致殘率高，嚴重威脅患者的健康〔1，2〕。目前AMI發病機制尚未闡明，但心肌細胞凋亡是AMI早期的重要原因之一，是引起心肌重構及心力衰竭的重要因素之一。因此，抑制心肌細胞凋亡對于AMI的抑制非常重要〔3〕。miRNA作為內生性、序列結構在進化上高度保守的長度約為18～23 nt的一類非編碼RNA分子，通過靶向結合于下游靶基因，通過調控靶基因的轉錄和降解，對細胞的增殖與凋亡、細胞的生長與分化等生物學行為進行參與。研究表明miRNA能特異性表達于心肌細胞中，且miRNA在AMI、心肌肥大、心律失常、心力衰竭等多種心血管疾病中異常表達〔4，5〕，其中發現miR-221在AMI患者心肌組織有較高的表達，但其機制尚未可知〔6～8〕。本研究旨在探討miR-211在AMI大鼠心肌損傷中的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗對象：選擇55只雄性SD大鼠體重(200±20)g，在(23±2)℃室內模擬晝夜環境飼養，可自由飲食和飲水。試劑及儀器:兔抗人Bax、Bcl-2、增殖細胞核抗原(PCNA)、Ki67、細胞外蛋白調節激酶(ERK1/2)、p-ERK1/2、GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、BCA試劑盒、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Caspase-9活性檢測試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司；Trizol 試劑盒，RT-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自美國Invitrogen；miR-221抑制劑、miR-221 NC、雙垂直電泳儀及配套凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad公司；多功能酶標儀購自瑞士TECAN公司。

1.2方法

1.2.1AMI建模與給藥〔3〕選取43只大鼠建AMI模型，操作過程如下：利用10%水合氯醛將大鼠進行麻醉，將大鼠的頸部和胸部毛發進行徹底消毒并剃除，切開皮膚，做1 cm直徑切口，連接呼吸機設置并調整呼吸頻率、潮氣量、呼吸時間參數。接著以大鼠胸部左側的第4根肋骨為手術切口，將大鼠皮膚逐層剝離，暴露出心臟，結扎冠狀動脈左前降支，心電圖出現ST段抬高，為AMI建模成功。40只大鼠成功建立AMI模型。隨機選取建模成功的36只大鼠作為本次研究的對象，均分為AMI組、對照組及抑制組，同時選取正常大鼠12只，按照建模大鼠操作，只對冠狀動脈穿線不結扎，作為假手術組。選取12只大鼠轉染慢病毒空載體miR-221-NC作為對照組；選擇12只攜帶miR-221抑制劑慢病毒作為抑制組；AMI組和假手術組隔日1次給予生理鹽水，連續2 w。

1.2.2檢測大鼠心臟功能 經過2 w的治療后，麻醉大鼠，彩超檢查心臟下述指標：左室射血分數(LVEF)，左室舒張末期內徑(LVEDD)和左室收縮末期內徑(LVESD)及左室長軸縮短分數(FS)。

1.2.3Tunel法檢測心肌凋亡指數(AI) 取心肌組織，石蠟包埋，切片，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、通透、PBS洗滌、反應液孵育、PBS洗滌、染色封片，顯微鏡下觀察計算細胞凋亡率，細胞棕黃色者為凋亡細胞。

1.2.4miR-221表達檢測 提取心肌組織中RNA，確保純度滿足測試后，行RNA逆轉錄，轉錄后行 PCR擴增，設計引物參照文獻。35次循環。

1.2.5Caspase-3及Caspase-9活性檢測 取適量大鼠心肌組織，勻漿并離心，加入胰蛋白酶裂解，離心獲得上清液，按照Caspase-3及Caspase-9活性檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.2.6Western印跡 Western印跡檢測Bax，Bcl-2，PCNA，livin，p-ERK1/2蛋白表達。處死大鼠后取心肌組織研磨成漿，離心后加入細胞裂解液，裂解30 min，取上清液檢測蛋白濃度。將蛋白樣品煮沸變性10 min后，上樣、電泳和轉膜后，將2%BSA封閉1 h，然后一抗溶液(兔抗Bax，Bcl-2，PCNA，Ki67，p-ERK1/2，GAPDH單克隆抗體，稀釋度為1∶100)于4℃孵育。第2天加二抗溶液，稀釋度為1∶200，室溫孵育1 h，滴入化學曝光液，在凝膠成像系統中曝光。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1miR-221在AMI大鼠心肌中的表達 與假手術組miR-211表達量(0.84±0.08)相比，AMI組(3.28±0.30)顯著提高(P<0.01)。

2.2miR-221 inhibitor在AMI大鼠心肌中miR-221表達量的作用 與假手術組miR-211表達量(0.88±0.08)相比，AMI組(3.22±0.30)及對照組(3.20±0.30)均顯著提高(P<0.01)；與AMI組及對照組相比，抑制組(1.35±0.13)顯著降低(P<0.01)。

2.3miR-221對AMI大鼠心臟功能的影響 與假手術組和抑制組比較，AMI組及對照組LVEF、FS水平均顯著降低，而LVEDD及LVESD水平均顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.4miR-221抑制劑對AMI大鼠心肌AI的作用 與假手術組心肌AI(2.48±0.20)相比，AMI組(36.71±3.64)及對照組(36.29±3.62)均顯著提高(P<0.01)；與AMI組及對照組相比，抑制組(7.43±0.69)顯著降低(P<0.01)。

2.5miR-221抑制劑對AMI大鼠心肌組織中Caspase-3及Caspase-9活性影響 與假手術組相比，AMI組及對照組中心肌組織中Caspase-3及Caspase-9活性明顯升高(P<0.01)；與AMI組及對照組相比，抑制組中心肌組織中Caspase-3及Caspase-9活性顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 miR-221對AMI大鼠心臟功能的影響及miR-221抑制劑對心肌組織中Caspase-3及Caspase-9的作用

2.6miR-221抑制劑對AMI大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、PCNA及Ki67蛋白表達量的影響 與假手術組比較，AMI組及對照組中Bcl-2、PCNA及Ki67表達量明顯下調(P<0.01)，Bax表達量明顯上調(P<0.01)；與AMI組及對照組比較，抑制組中Bcl-2、PCNA及Ki67表達量明顯上調(P<0.01)，Bax表達量明顯下調(P<0.01)。見圖1，表2。

表2 miR-221抑制劑對AMI大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、PCNA及Ki67表達量的影響

2.7miR-221 inhibitor對AMI大鼠心肌組織中p-ERK1/2表達量的影響 與假手術組p-ERK1/2表達量(1.88±0.16)比較，AMI組(0.85±0.08)及對照組(0.84±0.08)明顯下調(P<0.01)；與AMI組及對照組比較，抑制組(1.63±0.15)明顯上調(P<0.01)。見圖2。

1～4：假手術組、AMI組、對照組、抑制組；下圖同圖1 miR-221抑制劑對AMI大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、PCNA及Ki67蛋白表達量的影響

圖2 miR-221抑制劑對AMI大鼠心肌組織中p-ERK1/2表達量的影響

3 討 論

近年研究證實miRNA在AMI、心律失常、心力衰竭等心血管疾病中異常表達，包括miR-221〔4,9〕。miR-221與miR-222是同源miRNA，最初是從斑馬魚中克隆并得到證實，后來又在HL-60白血病細胞得到確證。miR-221定位于人類X染色體的p11.3區，在眾多腫瘤組織中高表達，因此被認為是一種有癌基因的miRNA〔10〕。Souza等〔6〕對心力衰竭大鼠心肌測量miR-221顯示為高表達。研究發現AMI患者miRNA表達異常，以miR-221表達為主，為健康人的3.89倍。同時還證實miR-221有心肌保護作用，能抑制缺血再灌注引起的心肌損傷〔8〕。

AMI過程中會產生大量的活性氧，使得心肌細胞凋亡，心肌損傷，甚至可能引起心力衰竭與心室重構。故控制AMI心肌細胞凋亡，對AMI的發展有遏制作用〔11，12〕。本研究結果表明miR-221 inhibitor可有效抑制AMI大鼠心肌細胞凋亡。

細胞凋亡受凋亡蛋白調控，例如Bcl-2家族，Caspase家族等。其中Bcl-2是最為多見的抑凋亡蛋白，Bcl-2可與促凋亡蛋白Bax結合，使得凋亡信號傳遞出現障礙，增加細胞存活和增殖速度。Bax還能自身形成二聚體，將細胞凋亡信號的傳遞至Caspase家族，幫助信號由Caspase-9傳遞至Caspase-3，最終誘導細胞發生凋亡。另外PCNA是一種從系統性紅斑狼瘡中發現的核內多肽，在細胞周期的G1期表達，在S期達到頂峰，是細胞增殖狀態評價指標之一。Ki67是從兔常規血清中發現的一種增殖性細胞核標志物，在G1后期出現，在M期達到頂峰，與細胞的有絲分裂密切相關。因此進一步探討miR-221抑制劑對細胞凋亡調控相關蛋白的影響有助于其機制的發現，本研究結果表明miR-221抑制劑能顯著上調Bcl-2，PCNA及Ki67表達，下調Bax表達，同時降低Caspase-3及Caspase-9活性，最終抑制AMI大鼠心肌細胞凋亡。另外細胞的凋亡、增殖、分化等生物學行為受多種信號通路的調控，ERK就是其中一種。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑中的關鍵調控點，在細胞靜息條件處于細胞質中，一旦被上游信號激活磷酸化后，能轉入細胞核內，調控靶基因的轉錄，進而參與細胞的生命活動〔13〕。且有研究證實miR-221與MEK/ERK信號通路密切相關〔14〕。本研究結果表明miR-221 inhibitor能通過上調p-ERK1/2表達，繼而調控細胞凋亡相關蛋白表達，最終抑制AMI大鼠心肌細胞凋亡。