蚯蚓毒物興奮效應研究進展

顧浩天 張天澍 滕海媛 常曉麗 王冬生 袁永達

摘要 近年來，大量研究發現以低劑量刺激、高劑量抑制為表征的雙相劑量效應關系（毒物興奮效應，hormesis）在動植物及微生物中廣泛存在。根據測試終點的不同，hormesis可被繪制成倒“U”型或“J”型曲線，主要表現為生物體因內穩態受到干擾而引起過度補償的生物學效應。蚯蚓作為“生態系統的工程師”，對改良土壤結構功能、提高土壤生物肥力均有積極有益影響。同時，蚯蚓作為毒理學研究中的指示生物和模式生物，被廣泛應用于評價污染物的環境風險。針對蚯蚓hormesis的研究進展進行綜述，以期為未來研究提供理論依據和參考。

關鍵詞 毒物興奮效應;污染物;蚯蚓;劑量-反應關系;測試終點

中圖分類號 X 171.5 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2021）15-0018-03

Abstract In recent years， a large number of studies have found that the biphasic doseeffect relationship （hormesis） characterized by lowdose stimulation and highdose inhibition is widespread in animals， plants and microorganisms.According to the different test endpoints， hormesis can be drawn as an inverted "U" or "J" curve， which is mainly manifested as the biological effect of overcompensation caused by the disturbance of the homeostasis of the organism.As the "engineer of the ecosystem"， earthworms have a positive and beneficial effect on improving soil structure and function and improving soil biological fertility. At the same time， earthworms， as indicator organisms and model organisms in toxicology research， are widely used to assess the environmental risks of pollutants.This article reviewed the research progress of earthworm hormesis in order to provide theoretical basis and reference for future research.

Key words Hormesis;Pollutants;Earthworm;Doseresponse relationship;Test endpoint

基金項目 上海市科技興農重點推廣項目“稻田秸稈蚯蚓原位處理模式與循環產業技術集成示范”（滬農科推字（2018）第4-14號）。

作者簡介 顧浩天（1993—），男，遼寧阜新人，研究實習員，碩士，從事農藥生態毒理效應及環境風險、農業害蟲生理分子調控機理研究。*通信作者，副研究員，碩士，從事農作物有害昆蟲的生理特性及綜合治理研究。

收稿日期 2020-12-05

劑量效應關系是污染物毒性風險評價中最基本、最核心的概念之一。環境中污染物通常以極低劑量存在，而大多數研究僅僅關注污染物的效應劑量，而忽略了其在低于未觀察到損害作用劑量（noobserved adverse effect level，NOAEL）下所產生的環境影響。研究發現亞效應劑量（subeffective dose）與高劑量下所誘導的生物效應截然相反，即毒物興奮效應（hormesis）[1-2]。根據所研究的測試終點，毒物興奮效應表現為倒“U”型或“J”型曲線的劑量-時間-效應關系[3-4]，其機理為毒物在極低劑量水平下打破生物體生理內穩態，刺激生物體產生過度補償或應激適應性響應來重建生理內穩態平衡[2]。毒物興奮效應現象在植物、動物、微生物中普遍存在[5]，可由有機或無機污染物、離子輻射、溫度、pH、鹽度等脅迫誘導產生[6-7]。毒物興奮劑量模型提示了污染物風險評價的閾劑量[8]，在毒理學研究中較閾值模型、線性非閾值模型更為常見[9]。因此探討毒物興奮效應的環境影響具有重要意義。

蚯蚓是土壤生態系統中最大的動物區系，通過掘穴、排泄、取食等生理活動改善土壤透氣性和孔隙度，維持土壤理化結構，促進土壤養分循環、團聚體形成、有機質降解礦化，提高土壤微生物多樣性、活性及生物肥力[10]。蚯蚓對土壤中低劑量污染物敏感，且能通過表皮被動吸收、主動取食、腸道消化等途徑與多種類型的環境污染物暴露接觸，因而被用作評價污染物環境風險及化學品毒性的指示生物[11]。近年來，已有大量關于蚯蚓響應污染物脅迫的hormesis現象報道，筆者針對此進行梳理和總結，以期為未來研究提供參考。

1 蚯蚓中的hormesis現象

毒物興奮效應是暴露于低濃度污染物條件下，生物內穩態產生的過度補償響應機制[9，12]，僅出現在低于NOAEL的較窄低劑量帶（hormetic zone）[12]。研究表明興奮效應具有普遍性，農藥、重金屬、抗生素、環境壓力等均可誘導蚯蚓形成低劑量促進-高劑量抑制的興奮效應，且該現象可能與蚯蚓受脅迫后體內氧化應激壓力產生活性氧簇（ROS）的動態變化及作用機制相關[13-14]。當環境污染物濃度較低時低劑量ROS可誘導生物體產生積極的響應[15]，促進體內抗氧化酶系如過氧化氫酶（SOD）、超氧化物歧化酶（CAT）、愈創木酚過氧化物酶（POD）及解毒酶系如細胞色素P450（CYP450）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、膽堿酯酶（ChE）、羧酸酯酶（CES）、谷胱甘肽硫轉移酶（GST）等活性增加;而當污染物濃度持續增加，過量ROS的積累破壞機體正常的氧化還原動態平衡，從而對生理代謝活動產生毒害作用[16]。

Hackenberger等[17-18]研究發現雙硫磷和馬拉硫磷濃度分別為0.12、0.10 ng/cm2處理2 h后 Eisenia fetida 膽堿酯酶（ChE）活性顯著增加，相比對照組（0 ng/cm2）分別提高3628%、30.30%。低劑量重金屬鎘（Cd）誘導 E.fetida 的 SOD、CAT活性增加且SOD（34.498%）的最大響應效應較CAT（27.637%）高，暗示SOD對Cd脅迫響應更敏感，毒物興奮效應產生可能與蚯蚓體內適應性通路的激活有關且不同受試終點的hormesis反應幅度不同[19]。同理，Cao等[20]報道 E.fetida 在濾紙中染毒48 h后，Cd誘導細胞色素P450（CYP3A4）酶活出現hormesis，可能與維持細胞和生理內穩態的適應性通路被激活相關;CYP450的hormesis在受毒死蜱脅迫的 Aporrectodea caliginosa [21]及苯并芘脅迫的 E.fetida [22]中也被發現。蚯蚓暴露于添加低劑量鑭元素的天然土中，其體內SOD和POD酶活、蛋白質含量等均表現hormesis[23]。0.01 mg/mL福爾馬林暴露2 h后誘導 E.andrei 的AChE活性增加12%（與對照組相比）[24]。 E.fetida 暴露于環丙沙星污染的土壤中，POD、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性表現hormesis[25]。Li等[26]研究發現恩諾沙星污染的人工土中， E.fetida CYP450 基因表達顯示低劑量（1 mg/kg）促進、高劑量（10～500 mg/kg）抑制的毒物興奮效應，表明毒物也可在分子水平上誘導蚯蚓的hormesis[12]。

污染物暴露也會誘導蚯蚓的存活、繁殖、生長、生物量等測試終點的hormesis。如添加Cd或Cu的人工土壤誘導 E.andrei 繁殖力產生hormesis，即低濃度刺激產繭量而高濃度抑制產繭量[27]。在 E.fetida 中，產繭量隨暴露草甘膦的濃度升高而增加[28]。Spurgeon等[29]研究發現Cu誘導 Lumbricus rubellus 幼蚓的生長發育產生hormesis。同理，Bustos等[30]研究也發現采礦區土壤砷（As）濃度低于45 mg/kg時誘導 E.fetida 幼蚓產量出現類似現象。Zhu等[31]研究發現低劑量氯化汞（0.780～3.125 mg/kg）暴露11～17 d后誘導 E.fetida 存活率增加114%～132%，推測可能與蚯蚓體內代謝解毒酶、抗氧化酶酶活的補償響應有關，并總結蚯蚓的存活率在hormesis研究中是敏感穩定的測試終點。 E.andrei 暴露于添加62.5 mg/kg氟蟲腈的人工土中，孵育28 d后存留生物量相比對照組高，暗示低劑量氟蟲腈誘導了hormesis[32]，也可能由于對照組蚯蚓將更多能量和營養物質用于交配及產繭過程，從而造成體重下降[33]。

此外，環境壓力也會誘導蚯蚓產生毒物興奮效應，如Wu等[15]報道土壤酸脅迫（pH 3.0～6.3）28 d后，誘導 E.fetida 的 CAT酶活性、金屬硫蛋白（MT）及總蛋白（TP）含量產生hormesis。低劑量輻射誘導蚯蚓體內成熟卵母細胞增加，產生有性繁殖，而高劑量輻射后無性繁殖顯著增加，暗示低劑量輻射也可誘導蚯蚓產生hormesis[34]。

2 蚯蚓hormesis的研究方法

近年來在蚯蚓hormesis研究中常用的方法包括濾紙接觸法、人工土壤法、微宇宙及中宇宙試驗（圖1）。人工土壤法、濾紙接觸法是經濟合作與發展組織（organization of economic cooperation and development，OECD）和國際標準化組織（international standardization organization，ISO）推薦的蚯蚓毒理試驗標準方法，主要以 E.fetida、E.andrei 這2種表棲蚓種為研究對象，在實驗室模擬條件下開展急性、亞急性毒性試驗[35-37]。Velki等[38-39]采用OECD法研究樂果對 E.andrei 的生態毒理效應，在濾紙接觸法中發現低劑量樂果誘導AChE和CES酶活性產生hormesis，而該現象在人工土壤法中并未發現[40]，這可能是由于在土壤試驗中選取的濃度過高，因此并未在較窄的低劑量帶觀察到毒物興奮效應。Domínguez等[33]采用ISO人工土壤法評估氨甲基磷酸（草甘膦代謝產物，AMPA）對蚯蚓 E.andrei 的毒理效應，結果發現濃度為1 000～2 500 μg/kg暴露56 d后，與對照組相比，AMPA誘導產繭量和幼蚓數量發生hormesis而顯著增加。

土壤微宇宙和中宇宙試驗是人工模擬的半野外多物種試驗系統，用以評估污染物對蚯蚓的生態毒性。將蚯蚓引入一個土壤單元（收集的、過篩的、完整的土樣）中，分析污染物在分子、細胞、組織、個體、種群、群落等水平上產生的生物學效應[41]。為接近真實環境試驗條件，污染物通常僅添加在土壤表面，且需要較多生物樣本容量以降低個體差異性[40]。Bundy等[42]采用半野外中宇宙試驗結合cDNA微陣列的轉錄組分析表棲蚓種 L.rubellus 對亞致死劑量Cu（10～480 mg/kg）的代謝響應，結果發現，40 mg/kg Cu處理后70 d其能量代謝及氧化應激相關基因和通路顯著上調，暗示Cu在分子水平上誘導蚯蚓hormesis。Velki等[40]采用微宇宙法將表棲蚓種、內棲蚓種、深棲蚓種暴露于3種殺蟲劑的田間推薦劑量，與對照相比，低劑量有機磷農藥暴露不同時間顯著誘導蚯蚓體內AChE、CAT、CES、GST酶活性及谷胱甘肽（GSH）含量的hormesis，結果詳見表1。

在真實環境中，土壤污染物常以極低的濃度存在。盡管OECD標準方法具有簡單快速、易操作、結果重現性好等優勢，但采用半野外微宇宙、中宇宙試驗可以最大程度模擬真實的自然條件，較為準確反映污染物環境相關的毒理風險數據，因此是環境污染及監測研究中的有力工具[3，40]。

3 小結與展望

在環境監測中，毒物興奮效應被視為生物暴露于污染物亞效應劑量的標志，因此建立毒物興奮模型對污染物毒性評價、化學品風險評估具有重要價值[3，9]。蚯蚓的毒物興奮效應可能與污染物誘導產生的體內氧化壓力相關[19，43]，因此在土壤生態毒理學研究中應注意污染物低劑量長期暴露引起的氧化壓力與hormesis之間的關聯性。針對蚯蚓毒物興奮效應的研究較為復雜，受試驗條件、土壤環境、污染物濃度、污染物類型、污染物的生物有效性、蚯蚓生態類群、暴露時間、受試終點等多重因素的影響。未來研究應選用合適的試驗方法、試驗濃度及高特異性、高靈敏的受試終點來檢測蚯蚓在低于NOAEL濃度下的脅迫響應，以解析不同污染物誘導蚯蚓產生毒物興奮效應的內在分子機理。此外，當土壤中多種有毒物興奮效應的污染物共存時，其聯合暴露引起蚯蚓的hormesis表現為相加、拮抗還是協同作用有待進一步探索。同時研究污染物劑量低于hormesis劑量時對蚯蚓的毒理學效應也是未來研究的難點與挑戰。

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