1株納豆激酶高產(chǎn)菌株的分離·篩選與復(fù)合誘變研究

鞏濤 魏傳軍 安明理 寧萌 周伏忠

摘要 為選育納豆激酶（Nattokinase，NK）高活性菌株，從4種不同風(fēng)味食品中分離得到26株菌株，通過(guò)酪蛋白平板初篩和液體發(fā)酵復(fù)篩，得到2株納豆激酶高產(chǎn)菌株，利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定為2株枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis ）。采用氯化鋰-紫外與亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變的方式，最終獲得1株納豆激酶活性達(dá)到2 338.01 U/mL的高產(chǎn)菌株SD3-3-6，該突變菌株納豆激酶酶活相較于初始菌株SD3提高了1.93倍，是1株具有應(yīng)用前景的高產(chǎn)菌株。

關(guān)鍵詞 納豆;納豆激酶;多肽;復(fù)合誘變;芽孢桿菌

中圖分類號(hào) Q 936.96 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2021）15-0159-03

Abstract In order to select nattokinase high activity strains， 26 strains were isolated from four different samples. Two nattokinase highyield strains were screened through primary screening and rescreening， and identified as two ?Bacillus subtilis ?strains by molecular biology technology. A highyield strain SD336 with nattokinase activity of 2 338.01 U/mL was obtained by lithium chloride UV and NTG compound mutagenesis. The final activity of nattokinase of SD336 was 1.93 times higher than that of the original strain SD3.

Key words Natto;Nattokinase;Polypeptide;Mutagenesis; Bacillus subtilis

基金項(xiàng)目 河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（212102310541）;河南省科學(xué)院科研項(xiàng)目（190305003、18JK16012）。

作者簡(jiǎn)介 鞏濤（1982—），男，山東臨沂人，助理研究員，博士，從事農(nóng)業(yè)微生物學(xué)研究。

收稿日期 2021-01-03

納豆激酶（natto kinase，NK）是納豆在發(fā)酵過(guò)程中由枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis ）產(chǎn)生的一種具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶[1]。大量研究結(jié)果顯示，納豆發(fā)酵過(guò)程中，不僅生成大量的短肽、多肽等具有特殊生理功能的生物活性肽，還能產(chǎn)生具有強(qiáng)溶栓功能的納豆激酶，可以被開(kāi)發(fā)為功能性食品、營(yíng)養(yǎng)食品和天然藥物等，具有廣泛的應(yīng)用前景[2-5]。納豆激酶作為一種潛在的溶栓藥物，與目前臨床使用的鏈激酶、尿激酶等溶栓藥物相比，除具有更好的安全性等諸多優(yōu)點(diǎn)外，成本也更加低廉[6-10]。然而，目前國(guó)內(nèi)篩選到的納豆激酶菌種的產(chǎn)酶活性和國(guó)外相比還存在較大差距，國(guó)內(nèi)報(bào)道的多數(shù)為500～3 200 U/mL[11-15]，如何分離與選育出納豆激酶高活性菌種是亟需解決的問(wèn)題。

筆者從4種納豆與豆豉食品中分離得到了26株產(chǎn)納豆激酶的菌株，對(duì)2株酶活較高的菌株通過(guò)氯化鋰-紫外與NTG復(fù)合誘變的方法實(shí)施多次誘變，最終得到納豆激酶酶活較高的高產(chǎn)菌株，旨在為納豆激酶的生產(chǎn)奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來(lái)源。

分別從購(gòu)于日本的山大納豆、濱莉納豆，中國(guó)的惟一齋八寶豆豉、永川豆豉中分離。

1.1.2 培養(yǎng)基。

酪蛋白初篩培養(yǎng)基[16]：酪蛋白5 g/L，葡萄糖1 g/L，酵母提取物1 g/L，K2HPO4 1 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，MgSO4 0.1 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.0～7.5。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨25 g/L，葡萄糖20 g/L，MgSO4 0.5 g/L，CaCl2 0.2 g/L，K2HPO4 2 g/L，KH2PO4 1 g/L。以上培養(yǎng)基于121 ℃滅菌20 min，備用。

1.1.3 主要試劑。

尿激酶、纖維蛋白原（血）、凝血酶，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，亞硝基胍（北京華越洋生物科技有限公司產(chǎn)品，中國(guó)），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 納豆激酶產(chǎn)生菌株的分離與初篩。

根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法稍作修改，取5 g樣品用滅菌研缽磨碎，加入20 mL無(wú)菌生理鹽水混勻，85 ℃水浴10 min殺死營(yíng)養(yǎng)體及雜菌，5 000 r/min 離心10 min，取上清。將上清進(jìn)行10倍梯度稀釋，吸取適當(dāng)稀釋后的樣品0.2 mL涂布酪蛋白平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，選擇透明圈較大的菌落作為初篩菌株。

1.2.2 液體發(fā)酵復(fù)篩。

將初篩菌株的種子液以5%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，5 000 r/min離心10 min，取適當(dāng)稀釋后的上清液10 μL于瓊脂糖-纖維蛋白平板，室溫下放置3～5 ?h，測(cè)量比較溶纖圈直徑，選擇納豆激酶酶活較高的菌株，作為誘變育種的出發(fā)菌株。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線繪制。

將待誘變菌株以5%接種量分別接種到裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔2 h取樣1次，在OD600下測(cè)定吸光值。以菌體生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.4 氯化鋰-紫外復(fù)合誘變。

根據(jù)文獻(xiàn)[18]描述略做修改，將菌株接種于含有0.8%氯化鋰的LB培養(yǎng)基，37 ℃200 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5 000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體細(xì)胞并稀釋為10-8 CFU/mL的菌懸液，取制備好的菌懸液10 mL于無(wú)菌9 cm培養(yǎng)皿中，置于距20 W紫外燈30 cm處的磁力攪拌器上，開(kāi)啟磁力攪拌器，分別照射30、60、90、120、150、180 s，將誘變后的菌懸液移入無(wú)菌試管中，避光冰浴1 h，冰浴后的菌液適當(dāng)稀釋，取200 μL涂布酪蛋白平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，選取透明圈較大的菌落進(jìn)行液體發(fā)酵復(fù)篩。

1.2.5 亞硝基胍（NTG）誘變。

將氯化鋰-紫外復(fù)合誘變處理之后的高活性菌株接入LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用滅菌的0.1 mol/L、pH 7.0磷酸鈉鹽緩沖液（PBS）制備10-8 CFU /mL的菌懸液，加入用上述PBS配制的亞硝基胍（NTG）溶液，制作終濃度0.1～1.0 mg/mL的誘變液，于37 ℃搖床中振蕩處理20 h，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，用緩沖液洗滌3次，適當(dāng)稀釋涂于酪蛋白平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，選取透明圈較大的菌落進(jìn)行液體發(fā)酵復(fù)篩[19]。

1.2.6 致死率的測(cè)定。

將未經(jīng)誘變處理的菌液（A）與誘變處理的菌液（B）適當(dāng)?shù)攘肯♂尯螅坎加诶业鞍灼桨迳嫌?jì)算菌落數(shù)。取致死率為60%～90%的組別進(jìn)行下一步試驗(yàn)[20]。致死率的計(jì)算公式如下：

致死率（%）=（ A-B）/A×100

1.2.7 高活性菌株遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證。

對(duì)經(jīng)誘變處理之后篩選到的高性菌株進(jìn)行傳代試驗(yàn)，連續(xù)傳8代，每次傳代后的菌株經(jīng)液體發(fā)酵，測(cè)量比較溶纖圈直徑，篩選納豆激酶酶活高的菌株。

1.2.8 高活性菌株的鑒定。

按細(xì)菌DNA提取試劑盒（Omega）操作手冊(cè)提取基因組DNA，用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rDNA基因序列[21]。將PCR產(chǎn)物送華大基因進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序序列進(jìn)行BLAST同源性對(duì)比分析，運(yùn)用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定所選菌株種屬[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆激酶高活性菌株的初篩與復(fù)篩

通過(guò)酪蛋白平板初步篩選出了26株長(zhǎng)勢(shì)良好且透明圈明顯的菌落。經(jīng)過(guò)瓊脂糖-纖維蛋白原平板對(duì)26株菌進(jìn)行復(fù)篩，最終得到5株具有較大透明圈的菌株（表1），按照“1.2.8”進(jìn)行了菌株的鑒定，綜合考慮選擇菌株SD3與WYZ14作為誘變育種出發(fā)菌株。

2.2 SD3、WYZ14生長(zhǎng)曲線繪制

菌株SD3、WYZ14生長(zhǎng)曲線（圖1）顯示，接種后4 h菌株SD3、WYZ14進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4～18 h是菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，20 h后菌體進(jìn)入穩(wěn)定期。加入氯化鋰的菌體生長(zhǎng)稍延后。由于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞處理，菌體活力旺盛，突變率高，重現(xiàn)性好，故后續(xù)試驗(yàn)選擇培養(yǎng)16 h的菌體進(jìn)行誘變處理。

2.3 氯化鋰-紫外復(fù)合誘變篩選結(jié)果

文獻(xiàn)報(bào)道，一般選擇致死率為70%～80%的劑量，誘變效果較好。從圖2可見(jiàn)，當(dāng)處理時(shí)間為120 s時(shí)，SD3與WYZ14致死率分別達(dá)到76.5%與78.2%。因此，氯化鋰-紫外復(fù)合試驗(yàn)選擇120 s作為最佳誘變劑量。

通過(guò)對(duì)氯化鋰-紫外復(fù)合誘變，篩選出22株透明圈與菌落直徑比值較CK有所增大的菌株，每出發(fā)菌株選擇1株酶活最高的誘變菌株分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，傳代培養(yǎng)后對(duì)酶活進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。表2顯示，誘變菌株SD3-3液體發(fā)酵液納豆激酶酶活較出發(fā)菌株提高了40.3%，為搖瓶發(fā)酵酶活最高的菌株，選用菌株SD3-3進(jìn)行NTG 誘變育種。

2.4 NTG誘變篩選結(jié)果

由圖3可見(jiàn)，隨著誘變劑量的增加與處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株致死率不斷增大。低劑量時(shí)，誘變效果不佳，高劑量會(huì)影響菌落再生。綜合考慮致死率與正突變范圍后，選擇NTG 濃度0.4 mg/mL，處理時(shí)間20 min 進(jìn)行誘變篩選。

通過(guò)NTG誘變篩選得到10株高產(chǎn)菌株，結(jié)果見(jiàn)圖4，菌株SD3-3-2、SD3-3-6、SD3-3-8與SD3-3-10的酶活較高，比出發(fā)菌株SD3-3分別提高42.3%、39.5%、47.4%與385%。

2.5 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性

將誘變高產(chǎn)菌株進(jìn)行傳代試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5，菌株SD3-3-4、SD3-3-6與SD3-3-9傳代8次遺傳穩(wěn)定性仍然較好，其他菌株從第3代開(kāi)始就回落，傳代6次以上菌株的高產(chǎn)特性基本消失。高產(chǎn)菌株SD3-3-6不僅遺傳穩(wěn)定，且酶活較高，傳代8次后，酶活穩(wěn)定在2 327.18 U/mL，是1株具備生產(chǎn)潛力的高產(chǎn)菌株。

3 結(jié)論

紫外與亞硝基胍誘變技術(shù)是傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)，具有快速、安全、有效、操作簡(jiǎn)便、正突變率高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于微生物誘變育種[23-24]。采用多種誘變劑交替的復(fù)合誘變通常比單一誘變劑處理能取得更好的結(jié)果，如彭鈺媛等[25]選用NTG 和紫外處理蠟樣芽孢桿菌（ Bacillus cereus ）獲得了解鉀能力提高了63.64%的誘變菌株。錢娟娟等[26]利用ARTP-亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變方法對(duì)中性蛋白酶出發(fā)菌株進(jìn)行復(fù)合誘變，選育出1株酶活較出發(fā)菌株提高90%左右的高產(chǎn)菌株。

筆者通過(guò)對(duì)SD3菌株進(jìn)行氯化鋰-紫外和NTG復(fù)合誘變，酪蛋白平板初篩，液態(tài)發(fā)酵復(fù)篩，從大量突變株中篩選到1株穩(wěn)定、高產(chǎn)納豆激酶的突變菌株SD3-3-6，其產(chǎn)酶能力從最初的1 203.56 U/mL提高到2 327.18 U/mL，提高了193倍。連續(xù)培養(yǎng)8代均維持較高的酶活水平，說(shuō)明該突變菌株遺傳性穩(wěn)定，是1株具有應(yīng)用前景的高產(chǎn)菌株，同時(shí)也說(shuō)明氯化鋰-紫外和NTG復(fù)合誘變是一種針對(duì)納豆激酶產(chǎn)生菌株有效的誘變技術(shù)。

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