HS-SPME/GC-MS 分析美味獼猴桃中的風味物質

朱云琦，董官勇，劉明春*

（1.四川大學生命科學學院，四川成都 610064；2.四川省鑫源圣果農業有限公司，四川什邡 618400）

果實中，酸味、甜味和香味共同構成果實的風味品質，糖、酸是決定果實內在品質的重要因素，而香味是人們對果實感官品質評價的重要因素。植物的花朵、果實、葉片、根莖等組織通過初生代謝和次生代謝合成數以千計的具有親脂性的小分子化合物[1]，主要分為醇類、酯類、醚類、醛類和萜類等，以其各自專有的氣味綜合表現為植物的獨特香氣[2]。至今水果的香氣成分已被鑒別出2 000多種，但主要的香氣成分各不相同[3]。Young 等[4]在收獲期測量了蘋果香氣變化，主要香氣成分為乙酸異戊酯（Isoamyl acetate）。涂正順等[5]對‘魁蜜’和‘早鮮’兩種獼猴桃果實香氣成分進行分析，從中檢測出26 種和44 種香氣物質，主要香氣物質僅有2-己烯醛（2-hexenal）、(E)-2-己烯醛等7 種物質對香氣有貢獻。

果實揮發性香氣中的重要物質包括支鏈脂肪族醛、酮、醇和酯類等，而脂肪酸是形成此類物質的重要前體物質。脂氧合酶通過識別不飽和脂肪酸（如亞油酸和亞麻酸）上的1,4-異戊二烯結構進行氧化催化反應，最終形成過氧羥基脂肪酸[6]。大多數果實都能將過氧羥基脂肪酸轉化為醇類物質，然后經過一系列酶類如乙酰基輔酶A 和乙醇脫氫酶（ADH）、氫過氧化物裂解酶（HPL）的催化作用將醇類物質轉化為醛類或酯類物質[7]。脂肪族支鏈和芳香族的揮發性香氣成分通常呈果香型或脂香型，大多數來源于氨基酸代謝途徑[8]。支鏈酮酸作為重要的代謝途徑中間物質可與輔酶A 生成酰基輔酶A，然后在醇酰基轉移酶（AAT）作用下生成酯類物質[9]。萜類化合物可參與植物體內重要的生理過程，大量研究表明，萜類物質由五碳前體物質在萜類合成酶（TPS）的作用下反應生成半萜類、單萜類、倍半萜類和雙萜類復合物，而這些物質所需的底物分別為二甲基烯丙基二磷酸、牻牛兒基二磷酸（GPP）、法呢基二磷酸（FPP）、牻牛兒酰牻牛兒基二磷酸（GGPP）。

我國作為獼猴桃屬植物的原產地，為實現獼猴桃產業的多元化，野生獼猴桃種質資源的研究和選育一直是研究者的主要方向，而在優質獼猴桃育種材料的研究中，揮發性香氣物質是衡量獼猴桃果實口感和風味品質的重要物質之一。本文以三種優質美味獼猴桃栽培品種‘秦美’‘華美’‘徐香’為對照，對三種美味野生獼猴桃材料‘kvf54’‘kvf6’以及‘鑫美’采用GC-MS 分析做香氣物質間的對比，探究了不同材料間香氣成分的差異，為獼猴桃的選育提供重要的基礎材料，同時為美味獼猴桃的果實質量與品種評價、分子輔助育種方法提供依據，對優質獼猴桃的品種選育和獼猴桃商品化生產、推動獼猴桃產業的發展有積極作用。

1 材料與方法

1.1 樣品及處理

實驗所需品種與材料均由四川省什邡市凱維孚公司提供，采摘于四川省什邡市下院村凱維孚獼猴桃基地。

本實驗所用美味獼猴桃包括以下三個對照品種：‘秦美’‘華美’和‘徐香’；三個篩選材料：‘kvf54’‘kvf6’和‘鑫美’。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

植物RNA 提取試劑盒，成都百菲特科技有限公司；HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉錄試劑盒，Vazyme 公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix 試劑盒，BIO-RAD 公司。

1.2.2 儀器與設備

手動SPME 進樣器與手動萃取頭，SUPELCO 公司；氣質聯用儀（GCMS-QP2010），Shimadzu 公司。

1.3 方法

將每個品種的果實采摘后經冷庫（1℃）處理一個月后，去皮、切碎、混合，進行SPME-GC-MS 分析，重復3次。另將剩余果實液氮速凍后用于提取RNA 以及反轉錄實驗。

1.3.1 SPME 條件

準確稱取混合物5 g 放于20 mL 的頂空瓶內密封。使用SPME 進樣器與手動萃取頭刺入頂空瓶后置于50℃恒溫水浴鍋中萃取40 min，結束后取出。

1.3.2 GC 條件

將萃取結束后的微萃取頭置于GC-MS進樣口，250℃解析3 min 后通過GC-MS 進行香氣成分的分析[10-12]。色譜柱為Rxi-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）彈性石英毛細管柱；載氣源為氦氣，載氣流量為1 mL/min；進樣口溫度為230℃；不分流進樣；升溫程序為以6℃/min 的速率由40℃升至280℃；解析時間為5 min。

1.3.3 MS 條件

EI 離子源；電力電壓為70 eV；離子源溫度200℃；接口溫度220℃；四級桿質譜溫度為150℃；倍增器電壓1 200 eV，發射電流為34.6 A；質量掃描范圍（m/z）為20～500。

1.3.4 結果分析

實驗結束后，結果分析采用計算機檢索以及對照標準圖譜庫（NIST 05）后導出PDF 格式的文檔，然后根據保留時間并結合相關的參考文獻，以此確定主要的香氣成分，通過歸一化積分法計算各個香氣成分的相對含量，結果以“平均值±標準差”表示。

1.4 果實香氣成分相關基因表達

參考文獻設計引物（Actin[13]、AdLox1-6[14]、AcTPS1[14]、AcATs16[14]）以Actin作為內參基因，對獼猴桃果實香氣成分相關基因進行定量PCR 檢測。實驗結束后，計算各基因相對表達量，計算公式見式（1）（2）。

式中，ΔCTn-每個基因的CT 值減去Actin的CT 值；ΔCT1-作為選擇其中任意一個ΔCT作為參照；Exp-相對表達量。

2 結果與分析

根據GC-MS 結果分析（見下頁表1），從6 個美味獼猴桃品種和材料中鑒定主要揮發性物質50 種，其中酯類18 種、醇醛類16 種、萜類7 種，‘秦美’‘華美’‘徐香’‘kvf54’‘kvf6’‘鑫美’中檢測到21、26、18、26、23、26 種主要香氣物質。

表1 不同獼猴桃果實香氣成分GC-MS 分析結果Table 1 GC-MS analysis results of aroma components of different materials of kiwifruit

2.1 酯類物質

‘秦美’‘華美’‘徐香’分別含有8、10、8 種主要酯類化合物，丁酸乙酯是這三種獼猴桃共有的化合物，相對含量分別為10.1%、36.89%、0.92%。‘kvf54’‘kvf6’‘鑫美’分別含有9、10、8 種主要酯類化合物。丁酸丁酯是這6 種美味獼猴桃品種共有的酯類化合物，相對含量分別為‘秦美’0.1%、‘華美’0.24%、‘徐香’0.27%、‘kvf54’0.12%、‘kvf6’0.15%、‘鑫美’1.37%。

2.2 醇醛類物質

‘秦美’‘徐香’中主要醇類物質有4 種，相對含量較高，分別為34.81%和20.96%；‘華美’‘kvf54’中主要醇類物質有6 種，相對含量分別為14.13%和2.05%；‘kvf6’主要醇類物質有5 種，相對含量為1.8%；‘鑫美’主要醇類物質有8 種，相對含量為5.3%。反式-2-順式-6-壬二烯-1-醇是‘秦美’‘華美’‘徐香’共有的醛類物質，相對含量分別為0.25%、0.15%、0.14%。

續表1

‘秦美’‘華美’‘kvf54’‘kvf6’中主要醛類物質有3種，相對含量分別為0.78%、1.94%、1.39%、0.64%，且‘秦美’和‘華美’主要醛類物質相同，為正戊醛、異戊醛和壬醛；‘徐香’和‘鑫美’中主要醛類物質有2 種，相對含量分別為0.89%、1.42%。

2.3 萜類物質

‘秦美’‘徐香’‘kvf6’‘鑫美’中主要萜類物質有3種，相對含量分別為1%、5.95%、1.04%、5.3%，2-丁烯是這四種美味獼猴桃共有的萜類化合物，相對含量分別為0.1%、1.15%、0.15%、4.74%；‘華美’‘kvf54’中主要萜類物質有4 種，相對含量分別為4.05%、0.8%，1,3-環戊二酮、芳樟醇是這兩種美味獼猴桃材料共有的萜類化合物；芳樟醇是6 種美味獼猴桃材料共有的萜類化合物，相對含量分別是0.8%、0.45%、4.63%、0.08%、0.8%、0.43%。

2.4 美味獼猴桃后熟過程香氣合成相關基因表達量

如圖1（見下頁）所示，以‘徐香’為對照，AdLox1、AdLox4、AdLox5在‘kvf54’中表達量顯著性上調2.18 倍、4.77 倍、4.01 倍，但AdLox6、AcTPS1在‘kvf54’中表達量低于‘徐香’；‘華美’中AdLox1、AdLox2、AdLox6、AcTPS1與AcAT16的表達量均低于‘徐香’，且AdLox6的表達量顯著低于‘徐香’，AdLox3在‘華美’中的表達量是唯一高于‘徐香’的，且差異顯著，表達量相差2.75 倍；‘鑫美’中AdLox5、AcAT16基因表達量顯著高于‘徐香’，分別高5.89 倍和5.34 倍，其余基因的表達量除AdLox2在‘鑫美’中低于在‘徐香’中且無顯著性差異外，均與在‘徐香’中表達量持平；AdLox1、AdLox2、AdLox3、AdLox5、AdLox6在‘kvf6’中表達量顯著上升4.4 倍、3.37 倍、3.35 倍、7.27倍、1.61 倍，同時，‘kvf6’中AcTPS1與AcAT16基因表達量也比在‘徐香’中高2.5 倍、7.8 倍，AdLox4在‘kvf6’中與‘徐香’相比并無顯著性差異；‘秦美’中AdLox3、AdLox6與AcTPS1的表達量相比‘徐香’顯著提高3.83 倍、1.51 倍、2.39 倍，AdLox1、AdLox4、AdLox5、AcAT16在‘鑫美’中的表達量低于‘徐香’，但無顯著性差異，其余基因的表達量均與在‘徐香’中的無明顯差異。

圖1 美味獼猴桃果實后熟過程中果實香氣合成相關基因表達量Fig.1 The expression of genes related to fruit aroma synthesis during the ripening of kiwifruit

3 討論與結論

香氣物質含量是影響獼猴桃后熟過程中品質與口感的重要因素[15]，國內外研究獼猴桃香氣成分的報道較多[16]。因為獼猴桃品種或時期的不同，揮發性物質包括酯類、醇醛類和萜類化合物各自的風味物質含量也大不相同[17]。研究測定了6 種獼猴桃后熟過程中的揮發性成分，不同材料之間揮發性物質各不相同。AdLox1-6、AdADH1、AdADH2、AcTPS1與AcAT16的表達量也在不同品種間存在差異，與酯類、醇醛類和萜類化合物含量存在一定的相關性。

研究發現，在美味獼猴桃中亞油酸、亞麻酸在LOX催化作用下產生C6、C9 醛后，在乙醇脫氫酶（ADH）的作用下形成醇類物質后，可經酰基轉移酶（AAT）的催化最終形成酯類物質[18]。系統發育分析生成已知植物LOX 家族的成員可以分為兩個主要的集群組，第一組9-LOX（促進植物器官發育和果實成熟），包含AdLox2和AdLox5，第二組13-LOX（參與合成六碳醇類、醛類）[14]。本實驗結果表明，‘kvf54’與‘徐香’相比，AdLox4表達量具有顯著的增加，且增加幅度大，GC-MS 分析結果也顯示‘kvf54’具有比‘徐香’更多含量的醛類物質；‘kvf6’和‘鑫美’中AdLox5的表達相比于‘徐香’而言顯著上調，GC-MS 分析結果顯示‘鑫美’具有比‘徐香’更多含量的醛類物質，但是‘kvf6’醛類相對含量較少，原因可能是還有其他Lox基因在‘徐香’中上調表達導致；‘秦美’‘華美’中AdLox3相比于‘徐香’的表達量上調更加明顯，醛類物質相對含量也多于‘徐香’。

獼猴桃果實軟化過程中,酯類含量增加[5]，前人報道發現AcAT16參與果實中酯類的合成[19]。‘鑫美’和‘kvf6’中酯類相對含量較高，酯類合成相關基因AcAT16在‘鑫美’以及‘kvf6’中表達具有顯著性差異，說明在兩種材料果實采摘后會大量合成酯類物質；‘秦美’‘kvf54’‘華美’和‘徐香’中酯類相對含量較少，AcAT16的表達量與對照相比也無顯著性差異。萜類物質對植物的生長發育有很重要的作用，大量研究表明萜類物質是由TPS 催化五碳前體物質生成，其中關鍵酶類包括3-羥基-3-甲基戊二酰基輔酶A 還原酶（HMGR）和脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構酶（DXR）[20]。GC-MS 結果表明，三種美味獼猴桃果實均檢測到特征性萜類香氣物質桉油精，研究報道桉油精在擬南芥中的生物合成推測是由AcTPS1基因調控的[21]。‘秦美’與‘鑫美’中檢測到桉油精成分，AcTPS1表達量相對‘徐香’上調幅度較小。‘華美’中檢測到桉油精成分，但AcTPS1與‘徐香’并無顯著性差異，‘kvf6’中AcTPS1表達較高，但并未檢測到桉油精成分，原因可能是萜類化合物含量還可以受HMGR、DXR 這兩種酶的調控基因表達影響。