25℃泡菜自然發酵過程中微生物菌群消長規律的研究

陸曉晴，祁 微，徐 晴，宋秀雯，何 星，周 佳，田寶霞

（淮陰工學院，江蘇淮安 223003）

泡菜是以新鮮時蔬為基本原料，在乳酸菌、醋酸菌及酵母菌等的協同作用下進行厭氧發酵制成的[1]。從3 000 多年前的商周起，我國泡菜就已經初具雛形[2]，且一直以來深受百姓喜愛。自1900 年開始，國內外出現了關于發酵蔬菜中微生物的系統性研究。Pederson[3]率先對發酵泡菜的微生物做出研究，首次提出了蔬菜發酵啟動菌的概念，最后證實該菌是腸膜明串珠菌。方心芳[4]認為，泡菜自然發酵時，多種微生物協同合作完成發酵，乳酸菌主攻產酸。吳云[5]從市售傳統發酵泡菜中篩選出15 株乳酸菌，研究發現，植物乳桿菌產生低pH 且對膽鹽具有較強耐受力；添加植物乳桿菌用于發酵，可縮短泡菜發酵時間，降低膽固醇含量。Albury等[6]以酸黃瓜為自然發酵原料，通過實驗發現，酸黃瓜發酵前期以異型發酵為主，后期以同型發酵為主。Sanchez等[7]以橄欖為研究對象，將自然發酵時的理化指標、菌相消長情況與以戊糖乳桿菌為發酵劑時的情況做比較，發現自然發酵速率低于接種發酵，但主要酸產物最終達到平衡。Yildiz 等[8]研究了多種菌相協同發酵包菜的情況，發現當多種菌樣交聯時會相互刺激，加快發酵進程。

盡管我國泡菜產量高，技術水平也越來越成熟，但缺乏足夠的基礎研究，且對于泡菜發酵過程中多菌種代謝機制尚不明確，這阻礙了發酵生產工藝的發展進程，因此亟需更多關于蔬菜發酵中微生物菌群消長代謝規律的深入研究。本文觀察了從25℃發酵泡菜中微生物的生長情況，探索了包菜在特定溫度下發酵，微生物菌系及其動態規律，以期準確掌握發酵過程中泡菜制品的微生物代謝活動，為提高泡菜質量發酵提供依據，同時也為發酵蔬菜的工業生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮包菜、干辣椒、野山椒、去皮生姜、泡菜鹽、老冰糖，均購自本地超市。

考馬斯亮藍G-250 試劑，北京康為世紀生物科技有限公司；DNS 試劑，北京生東科技有限公司；氫氧化鈉、吐溫-80，上海久億化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純；牛血清蛋白，南京奧多福生物科技有限公司；酵母浸粉，北京奧博星生物技術有限公司。瓊脂，德國BioFroxx；牛肉浸膏，國藥集團化學試劑有限公司；M17 培養基，青島高科技工業園海博生物公司；麥康凱瓊脂培養基，杭州微生物試劑有限公司；虎紅瓊脂培養基，江蘇宜興市永信生物有限公司；以上試劑均為生化試劑。

1.2 儀器與設備

雷磁PHS-3E 型pH 計，上海精密科學儀器有限公司；250-D 型光照培養箱，國華電器有限公司；unico UV-2100 紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；艾本德5804R 臺式高速大容量離心機，上海珂淮儀器儀器有限公司；JA2603B 電子天平，上海精密科學儀器有限公司；DH-6000AB電熱恒溫培養箱，金壇市城東科輝儀器廠；SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺，蘇州凈化有限公司；HYG-C型多功能搖床，蘇州市培英實驗設備有限公司。

1.3 培養基

本實驗中所使用的培養基主要有M17 培養基、MRS培養基、麥凱康瓊脂培養基、虎紅培養基、GYC 培養基，培養基配方如表1 所示。

表1 培養基的配方Table 1 Formulation of culture medium

1.4 泡菜的制作

將包菜洗凈，晾干后撕成塊狀備用，按照表2 中的配方配制，密封后放入25℃恒溫保溫箱中發酵，整個操作過程中要求不能進入生水。

表2 不同配方的原料用量Table 2 Raw material consumption of different formulations

1.5 測定指標與方法

1.5.1 pH 值和酸度的測定采用pH 計直接測定泡菜發酵液的pH，測量3 次后取平均值。酸度的測定采用酸堿滴定法測定。

1.5.2 可溶性蛋白含量的測定

采用牛血清蛋白繪制標準曲線。稱取約10 g 發酵泡菜于研缽中充分研磨后，準確稱取1 g 于離心管中，加入3 mL 去離子水，3 500 r/min 離心15～20 min，取上清液1 mL 作待測樣品，測定并記錄A595。根據標準曲線，計算出可溶性蛋白含量。

1.5.3 亞硝酸鹽含量的測定

亞硝酸鹽含量采用鹽酸萘乙二胺比色法測定[9]。

取9 支潔凈干燥的50 mL 比色管，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 的5 g/mL 亞硝酸鈉標準溶液，然后每管加對氨基苯磺酸溶液2 mL、鹽酸奈乙二胺溶液1 mL，用去離子水定容至50 mL，振蕩搖勻，待15 min 后，0 號管作空白對照，在538 nm 波長下比色，繪制標準曲線。

稱取10 g 左右發酵泡菜于研缽中充分研磨后，準確稱取5 g 于50 mL 燒杯中，加入10 mL 去離子水、12.5 mL硼砂飽和溶液混合均勻，用150 mL 去離子水將樣品勻漿液洗入250 mL 容量瓶中，80℃水浴20 min。取5 mL 亞鐵氰化鉀溶液于容量瓶中，振蕩，再加入5 mL 乙酸鋅溶液，充分攪拌混勻，使蛋白質沉淀。加去離子水定容至250 mL，搖勻，待30 min 后過濾，將初次過濾得到的濾液廢棄，隨后的濾液作為樣品，測定其中的亞硝酸鹽含量。

1.5.4 還原糖含量的測定

還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定[10]。

1.5.5 微生物計數

采用稀釋平板計數法進行各菌相的計數[11]。將每日無菌取樣的包菜發酵液1 mL 于滅菌干燥試管中，再加入9 mL 無菌生理鹽水混勻后進行梯度稀釋，每個稀釋度涂布三個平板，計數取平均數。用于檢測乳酸球菌、乳酸桿菌、腸道桿菌的M17、MRS、麥康凱培養基于37℃培養48 h；用于檢測酵母菌與醋酸菌的虎紅和GYC 培養基于30℃培養48 h。

1.6 數據處理

采用Origin 9.0 數據處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 不同配方理化指標的測定結果

檢測了實驗中3 個不同配方下的pH 值以及還原糖、可溶性蛋白和亞硝酸鹽含量，具體結果見表3（見上頁）。

表3 不同配方的理化指標Table 3 Physical and chemical indexes of different preparations

經對比發現，配方1 中pH 值最低，還原糖、可溶性蛋白含量相對較高，亞硝酸鹽含量居中。配方2 中亞硝酸鹽含量最高，還原糖含量最低。配方3 中亞硝酸鹽含量最低，但pH 值最高。綜合口感與氣味，按配方1 制作出來的泡菜樣品香味最純正濃郁，爽脆程度也最佳；從健康角度來說，配方1 制作出的泡菜樣品亞硝酸鹽含量遠低于我國亞硝酸鹽安全含量的國家標準GB2714—2003《醬腌菜衛生標準》規定的亞硝酸鹽殘留量不得超過20 mg/kg[12]，健康程度較高。綜合考慮下，將配方1 確定為最佳配方，以配方1 制作的泡菜進行后續的理化指標檢測。

2.2 pH 和酸度的變化

pH 值和酸度變化是泡菜自然發酵過程極為關鍵的特性參數，影響微生物數量及其代謝物活動[13-15]。如圖1所示，隨著發酵時間的延長，pH 值逐漸下降，酸度上升，最后都趨于穩定。pH 的初始值為6.35，酸度的初始值為0.01%，在0～3 d 時，pH 值下降速度較快，而3～6 d 時，pH 值下降開始緩慢并逐漸趨于穩定，酸度也趨于穩定。發酵完成時，pH 為3.8，可滴定酸度為0.6%。

圖1 25℃泡菜自然發酵過程中pH 值和酸度的變化Fig.1 Changes of pH and acidity of pickles during natural fermentation at 25℃

2.3 可溶性蛋白含量的變化

可溶性蛋白質在發酵過程中被分解成氨基酸等物質，影響泡菜的色澤和風味[15]。泡菜在25℃恒溫箱中自然發酵時可溶性蛋白含量變化如圖2 所示。由圖可知，在整個發酵過程中，泡菜的可溶性蛋白含量不斷下降，最后趨于平穩。在發酵第1 天，可溶性蛋白含量急劇下降，由最初的2.232 mg/mL 降至0.345 mg/mL，隨后幾天可溶性蛋白持續下降，但速度明顯減緩，逐漸到達一個穩定狀態，到發酵第6 天時只有0.040 mg/mL。

圖2 25℃泡菜自然發酵過程中可溶性蛋白含量的變化Fig.2 Changes of soluble protein content of pickles during natural fermentation at 25℃

2.4 亞硝酸鹽含量的變化

一般來說，較高含量的亞硝酸鹽也會存在于新鮮的蔬菜中，因為吸收硝酸鹽是蔬菜生長中合成所需植物蛋白的必經之路。由圖3 可以看出，泡菜從入瓶開始，亞硝酸鹽含量為7.6 mg/kg，經過1 d 后到達最高峰，為12.7 mg/kg；之后亞硝酸鹽含量開始下降，在4～6 d 時，亞硝酸鹽幾乎呈直線下降，最后降至0.78 mg/kg。可見，泡菜在25℃恒溫箱中自然發酵時，亞硝酸鹽含量處于安全狀態，并未超標，在發酵末期亞硝酸鹽較低，適宜食用。

圖3 25℃泡菜自然發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.3 Changes of nitrite content of pickles during natural fermentation at 25℃

2.5 還原糖含量的變化

泡菜在25℃恒溫箱中發酵時還原糖量變化如圖4所示。從圖中可以看出，25℃泡菜自然發酵中還原糖含量總體呈下降趨勢。0～1 d 時，還原糖下降速度較快，從初始值4.99 mg/g 降至3.37 mg/g；2～4 d 時，由3.06 mg/g降至2.58 mg/g，可見下降速度明顯減緩。5～6 d 時，還原糖含量處于一個相對穩定的狀態，達到2.52 mg/g，此時微生物代謝過程趨近停止。

圖4 25℃泡菜自然發酵過程中還原糖含量的變化Fig.4 Changes of reducing sugar content of pickles during natural fermentation at 25℃

2.6 25℃泡菜自然發酵中微生物菌數的變化

25℃泡菜自然發酵過程中乳酸球菌、乳酸桿菌、酵母菌、霉菌、醋酸菌和大腸桿菌的菌數變化見圖5。

圖5 25℃泡菜自然發酵過程中微生物菌數的變化Fig.5 Changes of microbial count of pickles during natural fermentation at 25℃

由圖5 知，發酵過程中未檢測到霉菌的存在。各微生物的生長曲線顯示，除大腸桿菌，所有被檢測微生物的對數生長期均出現在發酵第1 天，大腸桿菌對數生長期持續到發酵第2 天，乳酸球菌、乳酸桿菌和醋酸菌的生長峰值均出現在發酵第3 天，而酵母菌和大腸桿菌生長峰值出現在發酵的第2 天，4 d 后所有微生物均處于衰退期；從菌的數量來看，在峰值階段乳酸球菌、乳酸桿菌和醋酸菌的菌數為8～9 lg（CFU/mL），而酵母菌和大腸桿菌的菌數為4～6 lg（CFU/mL），發酵4 d 后乳酸球菌、乳酸桿菌、醋酸菌、大腸桿菌和酵母菌的菌數分別為8、7～8、6～7、3～4、3 lg（CFU/mL）。由此可見，發酵過程中乳酸球菌、乳酸桿菌和醋酸菌處于絕對優勢，屬于優勢菌，在發酵過程中發揮了主要作用。乳酸菌和醋酸菌在影響發酵速度和泡菜口感方面起到了至關重要的作用。發酵過程也發現了有害菌大腸桿菌，尤其在發酵的前3 d 內，其菌數最高時可達到6 lg（CFU/mL），而當發酵4 d、pH 值降低至4 以下后，大腸桿菌菌數持續快速下降，發酵5 d 后菌數降低至接近3 lg（CFU/mL），說明從有害微生物的角度看，隨著發酵pH 值的下降，泡菜的安全性在升高。

3 討論

本研究研究了25℃包菜自然發酵過程中生理變化情況，初步掌握了酸度、還原糖、亞硝酸鹽、可溶性蛋白以及乳酸桿菌、乳酸球菌、醋酸菌等微生物的變化規律。發酵后第1 天可溶性蛋白含量、亞硝酸鹽含量、還原糖含量、發酵細菌數、乳酸球菌數、乳酸桿菌數、酵母菌數，以及醋酸菌數的變化速率均為最快。這表明本研究條件下，發酵初期是微生物快速繁殖代謝最為快速、泡菜原材料生化反應最為劇烈的階段。由微生物的生長速率可以看出，第1 天可溶性蛋白含量和還原糖含量主要與發酵中微生物的快速代謝有關；同時，泡菜鹽產生的高滲作用使得胞外滲透壓大于胞內滲透壓，導致泡菜內大量可溶性蛋白外滲流失，蔬菜組織細胞的衰亡導致大量蛋白酶的分泌，致使可溶性蛋白迅速降解。

隨著發酵的進行，pH 持續下降，第4 天開始pH 下降至4 以下，可溶性蛋白含量和還原糖含量降至穩定的水平，而被檢測微生物的生長處于衰退期，即微生物的數量處于下降階段。這表明，隨著發酵的進行，微生物的代謝消耗發酵容器中的氧氣，使得發酵趨向厭氧發酵，微生物將剩余的糖代謝并分泌有機酸，造成pH 下降和酸度上升，當pH 下降至4 以下后，絕大多數的微生物代謝活動受到抑制并進入衰退期，剩余的可溶性蛋白和還原糖維持在一個較為穩定不變的水平。

在發酵前期，泡菜的pH 較高，腐敗細菌的生命活動不能被有效控制，由細菌產生的硝酸還原酶會還原硝酸鹽，生成亞硝酸鹽[16]。泡菜中的酚類物質與VC 也將亞硝酸鹽類還原成硝酸鹽，但是生成亞硝酸鹽速率仍大于其被還原率，所以第1 天亞硝酸鹽處于上升期。24 h 后微生物發酵活動增強，乳酸菌變為第1 優勢菌，主導了發酵，泡菜瓶內pH 降低，逐漸抑制有害菌的生命活動。此時硝酸鹽還原力也不如發酵前期，亞硝酸鹽生成量降低，發酵液中的酸或酶類物質將會分解已存在的亞硝酸鹽，使整個過程中亞硝酸鹽變化曲線呈現“拋物線”形態。

由發酵過程中的pH 值、酸度、還原糖、可溶性蛋白以及微生物數量的變化規律可見，發酵4 d 后，即pH 值低于4 以后，進入發酵的相對穩定期，乳酸菌數量最多，其余依次為醋酸菌、腸道桿菌和酵母菌。在蔬菜發酵食品中適量的醋酸菌的存在是有利的，醋酸菌帶來的醋酸聯合乳酸賦予了泡菜獨特的香氣。發酵4 d 時，pH 值低于4 以后，有害菌的數量快速下降，同時亞硝酸鹽的濃度也進入快速下降期。說明，兼顧食用的安全性和口感，本研究中25℃包菜自然發酵至少4 d 是比較合適的。

4 結論

研究發現，泡菜在25℃恒溫箱中自然發酵早期是微生物快速繁殖的主要時期，發酵前3 d 各微生物分別達到各自的數量峰值，pH 值、還原糖與可溶性蛋白含量都是處于不斷下降狀態；在發酵pH 值低于4 以后，還原糖與可溶性蛋白含量逐漸趨于較低的穩定水平，亞硝酸鹽含量快速下降，微生物的增長都處于衰退期；整個發酵過程中乳酸球菌、乳酸桿菌、醋酸菌、酵母菌、腸道桿菌數量有差別，未檢測到霉菌，數量上總體是乳酸菌＞醋酸菌＞細菌＞腸道桿菌＞酵母菌＞霉菌。乳酸菌又分為球菌和桿菌兩類，球菌數量上先高于桿菌，而后在發酵中被桿菌超過，兩者在最高峰時都達到了8～9 lg（CFU/mL）。醋酸菌數量在峰值時達到8 lg（CFU/mL），略低于乳酸菌，可見乳酸菌和醋酸菌在25℃泡菜發酵中是重要的優勢微生物，在泡菜的整個發酵過程中發揮了重要作用，也是影響泡菜風味和口感的重要調控點。此外，控制發酵pH 值達到4 以下對于保證泡菜的安全性也是一個重要的步驟。