時間分辨熒光免疫層析法測定糧食中的黃曲霉毒素B1

張少波 鄧常繼 張海濤 朱啟思

摘要：采用時間分辨熒光免疫層析試紙條及配套的熒光定量分析儀，對糧食中黃曲霉毒素B₁的快速檢測進行了研究。結果表明，該方法的檢出限為0.8 μg/kg，定量限為2.6 μg/kg，不同水平的加標回收率在94%～108%。選取標準質控樣品進行測試，液相色譜法檢測結果與該方法結果基本一致。該方法準確可靠，操作簡便，適用于糧食中黃曲霉毒素B₁的快速檢測。

關鍵詞：時間分辨熒光免疫層析法;黃曲霉毒素B₁;糧食

中圖分類號：TS210.7文獻標識碼：ADOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20210618

我國糧食產量連續7年保持在6.5億t以上，實現糧食生產十八年連續豐收[1]。在糧食數量安全得到保障的前提下，糧食質量安全越來越受到重視，消費者對安全、健康、營養糧食產品的訴求益加強烈。近年來，受天氣等環境影響，真菌毒素成為威脅我國糧食質量安全的主要因素。據不完全統計[2]，我國每年因真菌毒素污染造成的糧食損失累計超過3 000 萬t。

真菌毒素是真菌在生長過程中產生的次級代謝產物[3]。致癌性是真菌毒素的主要危害，其中以黃曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁，AFB₁）致癌性最強，被國際癌癥研究所列為I級致癌物[4]。鑒于AFB₁的劇毒性和普遍性，早在2002年，國家質檢總局規定小麥粉、玉米、食用油、醬油、醋5類食品實行“市場準入制度”，必須檢驗AFB₁的含量[5]。近年，相關部門多次修訂真菌毒素限量標準，嚴格監管。

AFB₁的檢測方法主要有免疫親和層析液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法、酶聯免疫法、膠體金法等。免疫親和層析液相色譜法是測定真菌毒素使用最為普遍的方法之一，但其操作周期較長，需要用到的有機試劑較多、耗材較貴;液相色譜-質譜聯用法所需設備更為昂貴，酶聯免疫法和膠體金法易受基質干擾，容易出現假陽性或假陰性[6]。時間分辨熒光免疫層析法是近年發展較快的一種檢測技術，具有靈敏度高、檢測速度快、結果穩定等優點，已在食品檢測行業得到應用[7]。本文擬對該方法在稻谷、玉米等糧食樣品檢測中的應用進行研究，以期為其進一步推廣使用提供依據。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑

SW-2型時間分辨熒光免疫層析定量檢測儀、AFB1時間分辨熒光免疫層析定量檢測卡：江蘇省蘇微微生物研究有限公司;AL204-IC型電子天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司;3310型盤式實驗粉碎磨：波通瑞華科學儀器有限公司;Multi Reax型旋渦混勻器：德國Heidolph公司;MINI-7K型微型離心機：杭州米歐儀器有限公司;Milli-Q型超純水儀：美國密理博公司;20 ～ 200μL和100 ～ 1 000μL單道可調移液器：德國Eppendorf 公司。

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：德國Merck公司;AFB₁免疫親和柱、樣品稀釋液：江蘇省蘇微微生物有限公司;玉米全粉中黃曲霉毒素B₁成分分析標準物質[GBW（E）100386]、花生油中黃曲霉毒素B₁成分分析標準物質[GBW（E）100604]、糙米粉中黃曲霉毒素B₁成分分析標準物質[GBW （E）100607]及黃曲霉毒素B₁標準品[GBW（E）100302]：國家糧食和物資儲備局科學研究院。

1.2試驗方法

1.2.1樣品前處理

準確稱取2.00 g粉碎樣品（稻谷樣品需壟谷）于50 mL離心管中，加入20 mL 70%甲醇水至離心管中，渦旋提取2 min，高速離心5 min，取上清液。

1.2.2樣品檢測

測試前，將未開封的檢測卡及試劑平衡至25 ℃。將檢測卡平放，用移液器定量吸取100μL上清液加入900μL樣本稀釋液中，反復吸打5次以充分混勻，后再吸出100μL此混合液垂直滴加于加樣孔中，室溫下反應10 min后，將檢測卡放入時間分辨熒光免疫層析檢測儀中檢測;在儀器感應區中放置對應的標準曲線智能卡，在主界面的“測量”菜單中點擊讀取智能卡后，點擊“樣品測量”進行檢測儀器讀數完成后會自動計算出被檢樣本中的AFB₁含量，可選擇儲存及打印結果。

1.2.3檢測方法的評價

（1）定量曲線：將AFB₁的標準品，用50% 甲醇水定容配制成1 000 ng/mL的標準儲備溶液;采用0.4% 的吐溫-PBS（pH 7.2，0.01 moL/L）稀釋成0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 ng/mL的標準工作溶液。分別取100 μL加至層析卡的樣品孔中，每個濃度設置3個平行，由低濃度到高濃度進行檢測，時間分辨熒光儀檢測T 線熒光強度與C線熒光強度，計算T/C值。

（3）準確度：按照1.2.1的前處理方法，在陰性稻谷樣品中分別加入10、20、60μg/kg的AFB₁標準溶液，測定方法的加標回收率。

式中：P為加標回收率，%;c₁為陰性稻谷測定值，μg/kg;c₂為加標稻谷測定值，μg/kg;c₃為加標量，μg/kg。

（4）精密度：分別選擇低、中、高3種濃度的AFB₁標準工作溶液，采用不同批次的測試卡，10次重復試驗，計算批間和批內變異系數（CV）。

式中：CV為變異系數，%;SD為標準偏差，ng/mL;MN為平均值，ng/mL。

（5）與國標仲裁法的對比試驗：取不同基質不同濃度的AFB1標準物質，先用國標仲裁法——免疫親和層析液相色譜法測定，再使用時間分辨

熒光免疫層析法測定，進行對比驗證。

2結果與討論

2.1定量曲線

對系列標準工作溶液進行測試，以標準工作溶液濃度的自然對數值（InC）為橫坐標，各濃度標準液的T/C值與0 ng/mL標準液的T₀/C₀值的比值所得百分比為縱坐標，得到一條平滑的S曲線，如圖1所示。

由圖1可以發現，在0.01 ～ 1.0 ng/mL濃度范圍內，存在一段接近于直線的曲線，其線性方程為y = -15.704x + 23.702，相關系數R²= 0.994 8。由此，選定AFB₁標準曲線的線性范圍為0.01 ～ 1.0 ng/mL，并以AFB₁濃度為橫坐標，對應的T/C值為縱坐標，建立定量曲線，結果如圖2所示。

2.2檢出限和定量限

由表1可知，本方法的檢出限和定量限分別為0.8、2.6 μg/kg，優于GB 5009.22—2016第四法酶聯免疫吸附篩查法（方法檢出限為1 μg/kg，定量限為3 μg/kg）和LS/T 6111—2015膠體金定量檢測法（方法檢測限為2 μg/kg），滿足GB 2761—2017規定的糧食樣品AFB₁的限量要求。

2.3準確度

對陰性稻谷樣品進行3水平6平行加標回收率試驗，結果如表2所示。由表2可知，本方法加標回收率在94% ～ 108%，相對標準偏差在10%以內，滿足檢驗的要求。

2.4精密度

分別選擇0.025、0.1、1 ng/mL 3種濃度的AFB1標準工作溶液，按照1.2.2的檢測方法，采用不同批次的測試卡重復試驗10次，結果見表3。由表3可知，批內CV值在7.44%～9.43%，小于10%;批間CV值在11.90% ～ 14.65%，小于15%，說明該方法均一性良好。

2.5與國標仲裁法的對比試驗

分別采用液相色譜法和時間分辨熒光免疫層析法檢測玉米全粉中黃曲霉毒素B₁成分分析標準物質、糙米粉中黃曲霉毒素B₁成分分析標準物質、花生油中黃曲霉毒素B₁成分分析標準物質，結果如表4所示。由表4可知，在不同的糧食基質中，時間分辨熒光免疫層析法檢測值與液相色譜法檢測值較為一致，均在所測標準物質的標準值內。

3結論

本文對時間分辨熒光免疫層析法在糧食樣品的黃曲霉毒素B₁檢測進行了研究。該方法的檢出限為0.8 μg/kg，定量限為2.6 μg/kg，線性范圍為0.1 ～ 1 ng/mL，不同水平的加標回收率在94%～108%，批內與批間變異系數（CV）分別在7.44% ～ 9.43%、11.90% ～ 14.65%，均小于15%。選取不同基質的標準質控樣品進行測試，本方法與液相色譜法檢測結果基本一致，在所測標準質控樣品的標準值范圍內。上述結果說明，本方法的準確度和精密度滿足使用要求，且具有簡便、快速、經濟等特點，適用于玉米、稻谷等糧食的黃曲霉毒素B₁快速檢測。參考文獻

[1]我國全年糧食產量將再創新高糧食生產實現十八年連豐[EB/OL].（2021-11-01）[2021-11-20].http：//news.cctv.com/2021/11/01/ARTINEZgNLui74CXYKeN9y6H211101.shtml.

[2]王文珺，葉金，孫雙燕，等.糧食污染物的快速檢測技術研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（21）：5552-5558.

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Detection of AFB1 in Grain by the Time-resolved Fluoro-immunoassay

Zhang Shaobo1，Deng Changji2，Zhang Haitao3，Zhu Qisi1

（1. Guangdong Provincial Food and Strategic Reserves Assurance Center，Guangzhou，Guangdong 510050;

2. Guangdong Institute for Cereal Science Research，Guangzhou，Guangdong 510050;3. Jiangsu SUWEI Microbiology Research Co.，LTD，Wuxi，Jiangsu 214000）

Abstract：This research used time-resolved fluoro-immunoassay strip and assorted time-resolved fluoro-immunoassay portable quick tester to detect aflatoxin B₁in grain. The assay showed that the limit of determination and the limit of quantification were 0.8 and 2.6 μg/kg，respectively. The recoveries of samples at different levels were rang between 94% to 108%. The results of the standard quality control sample had a good agreement with those of HPLC. This method was accurate，sensitive and convenient. It is suitable for the rapid screening of AFB₁in grain samples.

Key words：time-resolved fluoro-immunoassay，aflatoxin B₁，grain