南瓜籽蛋白酶法改性及其功能特性研究

盧臣 張玉申 仝文君 胡振陽 都立輝

摘要：為深入開發南瓜籽蛋白、改善其乳化性能，利用胰蛋白酶對南瓜籽蛋白進行不同程度的酶解改性，將酶解蛋白與大豆油經高壓均質制備蛋白乳液并研究其穩定性。通過測量溶解性、分子量、疏水性、乳化性觀察酶解對蛋白性質的影響，測定乳液乳析指數、粒徑分布、界面蛋白濃度等研究酶解蛋白對乳液穩定性的影響。結果表明，胰蛋白酶提高了南瓜籽蛋白的溶解性、疏水性、乳化活性，且酶解后的蛋白乳液乳滴粒徑較小、分布均勻，界面蛋白濃度顯著增加，尤其是水解度為5%的蛋白乳液穩定性最佳。改性后的南瓜籽蛋白是一種良好的天然乳化劑。

關鍵詞：南瓜籽蛋白;酶法改性;乳液;穩定性

中圖分類號：TS229;TQ936.2文獻標識碼：ADOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20210624

南瓜籽含有豐富的油脂與蛋白質，榨油后的南瓜籽粕蛋白質含量可達到50% ～ 60%，是一種天然蛋白質材料[1]。南瓜籽蛋白氨基酸組成平衡性好，包括人體必需的8種氨基酸和兒童必需的組氨酸[2]4。與棉籽粕和菜籽粕相比，南瓜籽粕中不含對人體有害或有毒成分，是一種比較安全的蛋白質來源[3]。但由于其溶解性較差，大部分南瓜籽粕被用作動物飼料[4]2，造成了蛋白資源的浪費，研究南瓜籽蛋白有利于深入開發其增值產品，提高其利用率。

蛋白質具有親水親油的性質，能夠通過在油一水界面形成吸附層降低界面張力而起到乳化作用[5]，具備開發成安全性高、乳化性強的綠色乳化劑的潛力。而天然蛋白質的乳化性質往往受其結構、理化性質以及環境因素的影響，在食品加工應用上受到一定程度的限制[6]。目前，蛋白改性方法主要有物理改性、酶法改性、化學改性等[4]5-6。其中酶法改性條件溫和，產生的副產物少，對環境友好。但蛋白改性受酶的特異性、蛋白質酶解程度以及蛋白自身特性的影響，過度酶解蛋白質會產生大量的游離氨基酸和小肽，反而降低蛋白質的乳化，有效控制蛋白水解程度，可以改善蛋白質的兩親性，增強其乳化性[7]。胰蛋白酶是一種特異性蛋白酶，可以對精氨酸和賴氨酸的竣基末端進行高效水解網。曾有學者利用胰蛋白酶對大米蛋白[7]、脫殼核桃蛋白[8]進行限制性酶解，改善了其乳化性能。

南瓜籽蛋白以植物貯藏蛋白為主，類似于大豆蛋白、豌豆蛋白。其中，12 S球蛋白和2 S白蛋白兩種蛋白占南瓜籽總蛋白含量的59%%南瓜籽分離蛋白經酶促水解能夠吸附在油一水界面上，但易受乳脂化不穩定性的影響[10]。本實驗利用胰蛋白酶酶解南瓜籽蛋白，研究不同水解度的南瓜籽蛋白經過高壓均質處理形成乳液的穩定性影響，為南瓜籽蛋白作為乳化劑應用于食品工業中提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

脫脂南瓜籽蛋白粉（粗蛋白61.7%、總糖12.4%、水分7.2%、灰分10%、淀粉4%）、大豆油：市售;胰蛋白酶1：300（300 U/mg）：生工生物工程（上海）股份有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒：北京索萊寶科技公司;其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

AMF-10型超高壓微射流均質機：安拓思納米技術有限公司;ULTRA-TURRAX T18型高速分散器：德國IKA公司;Nano-ZS90型納米激光粒度儀：英國馬爾文公司;ZeissAxioScopeA1型熒光顯微鏡：德國奧伯科興卡爾蔡司公司;UV-VIS2401PC紫外分光光度計：日本島津公司。

1.3方法

1.3.1酶解蛋白制備

將南瓜籽蛋白溶于超純水中，配置成40 mg/mL 濃度的分散液，磁力攪拌2 h，4 ℃放置12 h，使其充分水化。用1 mol/L NaOH溶液將上述分散液調節至胰蛋白酶最適酶解條件，pH為8，水浴加熱，酶解溫度為37 ℃。加酶量為3 000 U/g，蛋白酶溶于少量超純水，直至蛋白酶完全溶于水后再加入到待酶解的蛋白分散液。酶解期間保持分散液pH為8，制備不同水解度的蛋白溶液。酶解結束后沸水浴5 min滅酶，待其恢復至常溫用1 mol/L HCl調節蛋白水解液液pH至7，轉速10 000×g離心15 min 兩次取上清液，真空冷凍干燥。

1.3.2水解度（DH）

在酶解過程中，每隔一段時間取20 mL酶解液，沸水浴5 min滅酶，冷卻至室溫后調節酶解液至pH 7，離心（10 000xg，15 min）取上清液。鄰苯二甲醛法[11]（OPA）測定水解度。絲氨酸標準品的制備：將40 mg絲氨酸溶于100 mL去離子水，分別稀釋成濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL，制作標準曲線。將200μL稀釋10倍的樣品與1.5 mL OPA試劑精確混合2 min，并用紫外可見分光光度計記錄340 nm處的吸光度。DH計算公式：

式中：DH為水解度，%;Serine NH₂為絲氨酸氨基當量;α為α-NH₂的平均解離度，0.970;β為0.342;h_tot為每克蛋白質中肽鍵的毫摩爾數，8.35 mequv/g。

1.3.3蛋白溶解性

南瓜籽蛋白水解液中的可溶性蛋白含量用BCA試劑盒測定，將含有Cu²⁺和BCA試劑的200 μL工作液添加到含有20μL梯度標準溶液（0.0 ～ 0.5 mg/mL的牛血清白蛋白）的96孔板，37 ℃保溫30 min，酶標儀在562 nm 條件下測量[2]36-37。總蛋白利用凱式定氮法測定。按式（3）計算蛋白溶解性。

式中：

c——蛋白溶解性，%;

m₁——水中溶解蛋白質含量，g;

m₂——樣品中總蛋白含量，g。

1.3.4SDS-PAGE分析

將蛋白質加樣緩沖液與蛋白水解液按比例配置，迅速放于沸水浴2 min，每個上樣孔體積取20 μL，使其最終樣品上樣蛋白含量為8μg。電泳儀設置測參數為120 V，90 min。將膠浸泡在考馬斯亮藍溶液中搖床染色1 h，電泳脫色液脫色24 h。

1.3.5表面疏水性

制備不同濃度的3 mL蛋白溶液（0.01 ～ 0.50 mg/mL）與20μL 8 mmol/L 1-苯胺基-8-萘磺酸鈉（ANS-Na）溶液混合;將熒光強度FI₁在熒光分光光度計（370 nm激發，5 nm狹縫;465 nm 發射，5 nm狹縫）上測量，而沒有ANS-Na的樣品的熒光強度稱為FI₀。通過線性回歸分析FI₁和FI₀之間的差異圖獲得的斜率相對于蛋白質濃度作為H₀的指標，所得結果R²>0.99。

1.3.6乳化活性

取18 mL溶液，分別加入2 mL大豆油進行20 000 r/min剪切2 min得到乳狀液，取30 μL乳液加入3 mL 1 mg/mL濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液稀釋，在500 nm波長處測吸光度A₀。靜置5 min 后，再次從底部各取30μL樣品，同上測定吸光度A₅[12]。乳化活性和乳化穩定性計算公式：

EAI=2×2.303×A₀×100/（C×Φ×10000）（4）

ESI=A₀/（A₀-A₅）（5）

式中：EAI為乳化活性，m²/g;ESI為乳化穩定性，min;N為稀釋倍數，100;C為乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質質量濃度，g/mL;Φ為乳化液中油相體積分數;A₀為0min時的吸光值;A₅為5min時的吸光值。

1.3.7乳液制備及其穩定性分析

將不同水解度的蛋白凍干粉配置成質量濃度為5mg/mL的蛋白溶液，加入體積分數為10%大豆油作為油相，混合液經過轉速20000r/min剪切2min預乳化，30MPa高壓均質3次處理。

（1）乳析指數：將均質乳化好的南瓜籽乳液分別分裝在20mL的透明玻璃瓶中，加入0.02g/L疊氮化鈉防止微生物生長，4℃靜置30d觀察乳液分層狀態。乳析指數是評價乳液穩定性的一個重要指標[13]，公式如下：

CI=（Hs/Ht）×100%（6）

式中：CI為乳析指數，%;Hs為下層清液高度，mm;Ht為整個乳液的高度，mm。

（2）粒徑及電位：粒徑大小以及其分布展示了乳液體系的分布狀態，是衡量乳液穩定性的重要指標[13]。將南瓜籽蛋白乳液各取3組平行樣品，稀釋液超水稀釋100倍后，參考Sarkar等[14]的方法用Nano-ZS90納米粒度儀進行粒徑分布、電位測定。Nano-ZS90納米粒度儀通過動態光散射和173°檢測器測定乳液的平均流體動力學直徑。另外，稀釋液1% SDS溶液稀釋100倍，用Nano-ZS90納米粒度儀進行界面表面積的測定。

（3）吸附蛋白濃度、界面蛋白含量：參考陳先鑫等[15]將新鮮乳液以15 000×g離心30 min，水相部分再次離心30 min。用帶有針頭的注射器將離心后的水相部分小心的取出，通過0.22μm的過濾膜過濾。用BCA法測定過濾液的蛋白濃度。

1.4數據處理

所有實驗均重復3次，采用Origin 8.0和SPSS 16.0對實驗數據進行統計分析，樣品平均值之間的差異性通過Duncan法比較（P<0.05）。

2結果與分析

2.1酶解蛋白性質

2.1.1水解度及溶解性

如圖1所示，水解度、溶解性均隨酶解時間增加逐漸增大而后趨于平緩。由于蛋白酶具有較強的專一性[16]，隨著酶解時間的增加，酶切位點逐漸減少，水解度、溶解度也趨于穩定。溶解性是蛋白質重要的物理性質，對乳化性有著較大的影響。蛋白經過酶解后，空間結構被局部展開，大分子的蛋白被水解成分子量較小的肽段或者氨基酸，蛋白比表面積增加，溶解性增強[2]38-39。水解度（DH）是反映蛋白質酶解肽鏈斷裂程度的重要參數，不同水解度的酶解蛋白乳化性質可能不同[17]。依照酶解時間與水解度的關系，分別各選取3個不同水解度DH 2%、DH 5%、DH 8%的蛋白酶解液進行研究。

2.1.2分子量

蛋白酶能將結構復雜的蛋白質轉變成低分子量的蛋白肽。如圖2所示，南瓜籽蛋白（PSP）分子量主要集中在70 kDa以下，最明顯的條帶出現在分子量在33 ～ 40 kDa和10 ～ 25 kDa，與Bucko 等[10]研究的南瓜籽蛋白分子量一致。在DH 2%的酶解蛋白中，胰蛋白酶將分子量為53 kDa的蛋白條帶酶解成小于40 kDa的蛋白。隨著水解程度的增加，40 ～ 33 kDa的蛋白條帶逐漸消失，被酶解成分子量更小的蛋白質。低分子量的蛋白質具有良好的溶解性，同時酶解會暴露出蛋白內部的疏水基團，疏水基團的增加可能會改善蛋白乳化性能[7]。

2.1.3疏水性

由圖3可知，經過胰蛋白酶酶解的南瓜籽蛋白疏水性明顯增加，疏水性隨著水解度增大而逐漸增大而后降低，在DH為5.7%時疏水性最大達到2 504±13，比未酶解蛋白的疏水性增加了7.4倍，可知胰蛋白酶酶解南瓜籽蛋白對疏水性有顯著影響，疏水性的提升可能使蛋白功能性質改變[18]50-51。酶解使南瓜籽蛋白疏水位點暴露，疏水性增加，而隨著酶解程度越來越高，蛋白逐漸被酶解成小肽或者氨基酸，親水性增加從而使其疏水性降低。

2.1.4乳化性及乳化穩定性

乳化活性反映蛋白質形成油水界面的能力強弱，乳化穩定性是指乳液乳滴保持分散不聚結、絮凝或乳脂化的能力[12]。如圖4所示，酶解蛋白具有比天然蛋白更好的乳化活性及乳化穩定性，且DH 5%的乳化活性比DH 2%、DH 8%水解程度的乳化活性高。由于南瓜籽蛋白經過適當的酶解，蛋白溶解性增加、疏水基團從內部釋放，從而使乳化性增力口。但隨著酶解時間的增加，大量小肽以及氨基酸含量逐漸增加，導致其在油一水界面的兩親性下降，乳化活性降低[7]。乳化活性與上述疏水性的趨勢一致，疏水性的增加有助于蛋白乳化活性的提升。

2.2乳液穩定性

2.2.1乳析指數

乳析指數可以從宏觀角度評價乳液物理穩定性，是關于油相和連續相之間平衡穩定狀態的指標，乳析指數越低，乳液狀態越穩定[19]。由表1可觀察到PSP乳液乳析現象嚴重，出現明顯的乳液分層，不能穩定乳液均一狀態;經過胰蛋白酶酶解后的蛋白乳析指數顯著性降低，說明胰蛋白酶對南瓜籽蛋白改性有助于形成穩定的乳液，而DH 5%的蛋白乳液30 d內未出現乳析現象，表明DH 5%乳液油水界面平衡性最佳。

2.2.2粒徑分布及Zeta電位

粒徑大小及其分布展示了乳液體系的分布狀態，是衡量乳液穩定性的重大指標[20]。如表1所示，酶解后的蛋白乳液粒徑顯著性小于PSP乳液，粒徑越小油滴難以聚集，乳液狀態也越穩定[13]。圖5 中，PSP、DH 2%蛋白乳液的粒徑曲線圖出現雙峰現象，表明乳滴分布不均勻且有兩種大小不同的粒徑，5皿左右出現峰的乳滴所占比例較小，但這些大乳滴往往影響了乳液穩定性。這主要由于乳液表面蛋白的乳化性較差，導致形成的乳液不能包埋成均一穩定的油滴顆粒[18]18-20。DH 2%和DH 8%的蛋白乳液比DH 5%乳液的平均粒徑較大且分布較寬，可能與酶解程度不同有關[16]，適當水解有助于將包埋在蛋白內部的疏水性基團暴露，使蛋白達到兩親性從而穩定乳液[7]。Zeta電位反映了膠體顆粒之間的電荷排斥作用，是表征乳液穩定性的重要指標。Zeta電位值為負值說明乳液表面存在陰離子，當電位的絕對值較高時，表面凈電荷越多，乳滴之間靜電斥力越大，乳液往往具有較高的穩定性和較小的顆粒[21]。表1中DH 5%的乳液電位絕對值最大，且與其他乳液電位值存在顯著性差異，表明DH 5%的蛋白乳液最穩定。

2.2.3吸附蛋白含量與界面蛋白

界面蛋白含量和蛋白吸附含量對乳液的穩定性有重要影響。蛋白吸附含量表示界面吸附蛋白的覆蓋率，蛋白吸附量越高，蛋白吸附至水一油界面的能力越強，乳液也越穩定[21]。如圖6顯示蛋白吸附含量隨著水解度增加先增加而后降低，DH 5%吸附蛋白含量最高且與其他蛋白乳液具有顯著性差異，表明DH 5%吸附至油一水的界面能力較強。界面蛋白濃度取決于吸附蛋白含量和乳滴的比表面積，界面蛋白濃度越高，乳液液滴對抗聚集的能力越強[15]。酶解蛋白的界面蛋白濃度均比PSP顯著性增加，表明胰蛋白酶酶解南瓜籽蛋白對其乳化性有著明顯改善。界面蛋白含量、吸附含量與蛋白的疏水性、乳化活性趨勢一致，與乳液的乳析指數、粒徑及電位趨勢相反，說明胰蛋白酶對南瓜籽蛋白改性有助于形成穩定的乳液，且DH 5%的蛋白乳液穩定性最佳。

3結論

本實驗利用胰蛋白酶對南瓜籽蛋白進行限制性酶解改性，酶解改性后的南瓜籽溶解度增加，蛋白分子量主要分布在25 kDa以下。不同酶解程度的蛋白影響其乳化性能，適當的水解程度有利于蛋白乳化性能的提高，疏水基團的有效暴露是提高乳化性能的關鍵。研究發現，DH 5%乳化性最高，能夠形成穩定的乳液，表明改性后的PSP在開發食品級乳液方面具有廣闊的應用前景。在此研究基礎上，胰蛋白酶酶解改善南瓜籽蛋白乳化性的機理還需從結構層面進一步探究，通過胰蛋白酶改善PSP乳液體系穩定性為南瓜籽蛋白在食品乳液加工中的應用提供借鑒與指導。

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Enzymatic Modification of Pumpkin Seed Protein and Its Functional Properties

Lu Chen，Zhang Yushen，Tong Wenjun，Hu Zhenyang，Du Lihui

（School of Food Science and Engineering，Nanjing University of Finance and Economics / Jiangsu Provincial Center for Synergy Innovation in Modern Grain Circulation and Safety/Jiangsu University Key Laboratory of Grain and Oil Quality and Safety Control and Deep Processing，Nanjing，Jiangsu 210023）

Abstract：Pumpkin seed protein was modified by trypsin in order to further develop pumpkin seed protein and improve its emulsifying properties. The protein emulsion was prepared by high pressure homogenization of enzymolysis protein and soybean oil and its stability was studied. The effects of enzymatic hydrolysis on the protein were observed by measuring solubility，molecular weight，hydrophobicity and emulsifying properties. The effects of the hydrolysate on the stability of the emulsion were investigated by emulsion index，particle size distribution and interfacial protein concentration. The results showed that trypsin improved the solubility，hydrophobicity and emulsifying activity of pumpkin seed protein. The size of protein emulsion droplets after enzymatic hydrolysis was smaller and distributed evenly，and the concentration of interfacial protein increased significantly. Especially，the stability of protein emulsion with a hydrolysis degree of 5% was the best. The modified pumpkin seed protein is a good natural emulsifier.

Key words：pumpkin seed protein，enzymatic modification，emulsion，stability