miR-7-5p和miR-152-3p聯合調控Wnt/β-catenin通路對乳腺癌細胞上皮-間質轉化及化療耐藥的影響

李 娜，張哲瑩，朱會芳，賀國洋，韓正華，原志慶，王凡平，王明永

文獻報道顯示，乳腺癌耐藥形成過程是一個多元而復雜的過程，除了與基因的調控有關外，還與信號通路的調控密切相關[1]。本課題組前期實驗結果證實，miR-7-5p和miR-152-3p可通過協同抑制乳腺癌耐藥細胞的上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)進程，降低乳腺癌紫杉醇耐藥性，但其具體的分子機制尚不清楚。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的核心因子，游離的β-catenin進入細胞核可與兔抗人T細胞因子4(T cell factor 4, TCF4)結合形成復合物，進而影響下游靶基因的異常轉錄，促進腫瘤的發生[2]。本實驗通過生物信息學軟件預測發現，miR-7-5p和miR-152-3p均與TCF4 3′UTR區域存在互補的結合位點，猜測miR-7-5p和miR-152-3p可能通過共同靶向TCF4介導Wnt/β-catenin信號通路參與乳腺癌細胞紫杉醇耐藥的形成。因此，進一步探討miR-7-5p和miR-152-3p協同抑制乳腺癌細胞EMT進程及紫杉醇耐藥的分子機制是否與共同調控Wnt/β-catenin信號通路有關，以揭示miR-7-5p和miR-152-3p調控乳腺癌紫杉醇耐藥形成的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細胞株Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl購于天津市光復精細化工研究所。兔抗人TCF4單克隆抗體購于上海煊翎生物公司。兔抗人β-catenin單克隆抗體購于美國Cell Signaling公司，熒光素酶活性檢測試劑盒購于美國Promega公司，乳腺癌MCF-7細胞株由本實驗室保存，MCF-7/TAX細胞株購于上海和序生物公司。

1.2 方法

1.2.1細胞轉染及處理 將對數生長期的MCF-7/TAX細胞以每孔106個接種至6孔細胞板上，置于細胞培養箱中常規培養。將細胞分為NC組(轉染陰性對照)、miR-7-5p組(轉染miR-7-5p mimics)、miR-152-3p組(轉染miR-152-3p mimics)和miR-7-5p/152-3p組(共轉染miR-7-5p和miR-152-3p)。根據上述分組進行轉染，轉染48 h后，采用Western blot法檢測各組細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin和TCF4的表達情況。將長勢良好處于對數生長期的miR-7-5p組、miR-152-3p組、miR-7-5p/152-3p組細胞分別接種至2個96孔細胞板上，一板細胞未做處理，另一板細胞分別給予20 mmol/L LiCl處理，并分別記為miR-7-5p+LiCl組、miR-152-3p+LiCl組、miR-7-5p/152-3p+LiCl組，采用Western blot法檢測細胞中β-catenin、TCF4、E-cadherin和vimentin蛋白的表達，Transwell小室實驗檢測細胞侵襲和遷移，MTT實驗檢測乳腺癌細胞紫杉醇耐藥性。

1.2.2雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-7-5p和miR-152-3p與TCF4的靶向關系 將對數生長期的MCF-7/TAX細胞以每孔2×104個接種至6孔細胞板上后，常規培養。待細胞達75%左右匯合度時，參照脂質體2000說明書步驟將miR-7-5p mimics、miR-152-3p mimics及陰性對照分別與TCF4-WT、TCF4突變型(TCF4-MUT)共轉染至MCF-7/TAX細胞中。轉染48 h后，參照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測細胞的熒光素酶活性。

1.2.3Western blot法檢測MCF-7/TAX細胞中β-catenin、TCF4、E-cadherin和vimentin蛋白的表達 各組細胞的總蛋白按試劑盒要求進行提取，總蛋白用BCA法進行定量。蛋白上清經SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳后轉移至硝酸纖維素膜，用TBST封閉1.5 h，一抗于4 ℃孵育過夜，按照ECL試劑盒說明書進行操作，X線片曝光、顯影、定影。GAPDH作為內參，采用凝膠成像分析系統以目的條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.2.4Transwell小室實驗檢測MCF-7/TAX細胞的侵襲和遷移 實驗前1天，以無血清的RPMI-1640培養基制備濃度為5 mg/mL Matrigel基質膠，將膠平鋪到Transwell小室的底部，室溫下自然凝固。加入無血清RPMI-1640培養基水化基膜30 min。取細胞懸液200 μL加入Transwell小室的上室中，并加入含10%胎牛血清的培養液600 μL，培養24 h后，取出小室，小心拭去上層小室內殘留的細胞，分別以4%多聚甲醛和5%結晶紫固定、染色各15 min。洗出染色液后，采用倒置顯微鏡觀察各組中的穿膜細胞數，結果以隨機選取3個視野內細胞數的均值表示。

1.2.5MTT法檢測MCF-7/TAX乳腺癌細胞紫杉醇耐藥性 將長勢良好的對數生長期的各組細胞以每孔105個接種至96孔細胞板上后，置于細胞培養箱中常規培養過夜。加入終濃度為0、20、40、60、80和100 μmol/L紫杉醇處理48 h。棄上清液后，加入20 μL濃度為5 g/L MTT溶液孵育4 h。加入150 μL DMSO溶液震蕩反應至MTT結晶重復溶解。采用酶標儀在490 nm波長處檢測各組細胞的光密度值。

2 結果

2.1 miR-7-5p和miR-152-3p與TCF4的靶向關系采用Targetscan軟件對miR-7-5p及miR-152-3p的靶基因進行預測，TCF4 3′UTR區域存在能夠與miR-7-5p及miR-152-3p互補的結合位點(圖1A)。結合相關資料，最終將TCF4作為研究對象，雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與NC組相比，轉染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics可使TCF4-WT報告基因載體的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05，圖1B)；但兩者對TCF4-MUT報告基因載體的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。

圖1 miR-7-5p和miR-152-3p與TCF4靶向關系的驗證：A.Targetscan軟件分析miR-7-5p和miR-152-3p與TCF4 3′UTR的結合位點；B.轉染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics后細胞的熒光素酶活性；與NC組相比，*P<0.05

2.2 miR-7-5p和miR-152-3p對MCF-7/TAX細胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響Western blot法檢測結果顯示，轉染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics后MCF-7/TAX細胞中Wnt/β-catenin信號通路關鍵因子β-catenin和TCF4蛋白的表達水平較NC組明顯降低(P<0.05)，且共同轉染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics后MCF-7/TAX細胞中β-catenin和TCF4蛋白的表達水平較miR-7-5p組或miR-152-3p組進一步降低(P<0.05，圖2)。

圖2 miR-7-5p和miR-152-3p對MCF-7/TAX細胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響：A.Western blot法檢測β-catenin和TCF4蛋白的表達；B.β-catenin和TCF4蛋白相對表達量；與NC組相比，*P<0.05；與miR-7-5p組或miR-152-3p組相比，#P<0.05

2.3 激活Wnt/β-catenin信號通路對MCF-7/TAX細胞EMT進程的影響在轉染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics基礎上給予Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl處理MCF-7/TAX細胞后，Western blot法檢測結果見圖3，Transwell小室實驗檢測結果見圖4和圖5。與miR-7-5p組或miR-152-3p組或miR-7-5p/152-3p組相比，給予LiCl處理后MCF-7/TAX細胞中β-catenin、TCF4和vimentin蛋白的表達水平明顯升高，而E-cadherin蛋白的表達水平明顯降低，且MCF-7/TAX細胞侵襲和遷移能力明顯增強(P<0.05)。

圖3 激活Wnt/β-catenin信號通路對β-catenin、TCF4、E-cadherin和vimentin蛋白表達的影響：A.Western blot法檢測β-catenin、TCF4、E-cadherin和vimentin蛋白的表達；B.β-catenin、TCF4、E-cadherin和vimentin蛋白的相對表達水平；1.miR-7-5p;2.miR-7-5p+LiCl；3.miR-152-3p；4.miR-152-3p+LiCl；5.miR-7-5p/152-3p；6.miR-7-5p/152-3p+LiCl; 與miR-7-5p組相比，*P<0.05；與miR-152-3p組相比，#P<0.05；與miR-7-5p/152-3p組相比，&P<0.05

圖4 激活Wnt/β-catenin信號通路對MCF-7/TAX細胞侵襲能力的影響：A.Transwell小室實驗檢測MCF-7/TAX細胞侵襲結果；B.各組中侵襲細胞數；1.miR-7-5p;2.miR-7-5p+LiCl；3.miR-152-3p；4.miR-152-3p+LiCl；5.miR-7-5p/152-3p；6.miR-7-5p/152-3p+LiCl;與miR-7-5p組相比，*P<0.05；與miR-152-3p組相比，#P<0.05；與miR-7-5p/152-3p組相比，&P<0.05

圖5 激活Wnt/β-catenin信號通路對MCF-7/TAX細胞遷移能力的影響：A.Transwell小室檢測MCF-7/TAX細胞遷移結果；B.各組中遷移細胞數;1.miR-7-5p;2.miR-7-5p+LiCl；3.miR-152-3p；4.miR-152-3p+LiCl；5.miR-7-5p/152-3p；6.miR-7-5p/152-3p+LiCl; 與miR-7-5p組相比，*P<0.05；與miR-152-3p組相比，#P<0.05；與miR-7-5p/152-3p組相比，&P<0.05

2.4 激活Wnt/β-catenin信號通路對MCF-7/TAX乳腺癌細胞紫杉醇耐藥性的影響在轉染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics基礎上給予Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl處理后，采用MTT法檢測MCF-7/TAX細胞紫杉醇耐藥性的變化。不同濃度紫杉醇作用下，miR-7-5p+LiCl組細胞增殖活力較miR-7-5p組明顯升高；同時miR-152-3p+LiCl組和miR-7-5p/152-3p+LiCl組細胞的增殖活力較miR-152-3p組、miR-7-5p/152-3p組也均明顯升高(P<0.05，圖6)。

圖6 激活Wnt/β-catenin信號通路對MCF-7/TAX乳腺癌細胞紫杉醇耐藥性的影響：與miR-7-5p組相比，*P<0.05；與miR-152-3p組相比，#P<0.05；與miR-7-5p/152-3p組相比，&P<0.05

3 討論

miRNA是一類內源性非編碼小分子RNA，可通過降解或者抑制靶基因mRNA的翻譯，在轉錄后水平對靶基因進行調控，影響細胞增殖、侵襲、遷移、EMT和耐藥形成等，與乳腺癌的發生、發展密切相關[3]。Mansoori等[4]的研究結果指出，miR-142-3p可通過靶向調控BTB-CNC異體同源體1(Bach-1)的表達減少EMT相關蛋白的表達，抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移。Yang等[5]指出，miR-125b可通過靶向調控軸突導向蛋白分子(Semaphorins 4C, Sema4C)表達抑制EMT表型逆轉乳腺癌細胞紫杉醇耐藥性。

除了與靶基因相互作用外，miRNA還可通過直接或間接調控相關信號通路的活化參與乳腺癌的發生、發展。Han等[6]的研究結果發現，異常高表達的miR-30d可通過靶向調控kruppel樣因子11(kruppel-like factor 11, KLF11)和激活信號轉導子與轉錄活化子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)信號通路的活化促進乳腺癌細胞增殖、侵襲、遷移能力和EMT進程。Li等[7]指出，miR-106b和miR-93通過靶向調控PTEN激活PI3K/AKT信號通路誘導乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移。Mohammadi-Yeganeh等[8]發現，miR-340可通過直接靶向調控Wnt信號通路抑制乳腺癌細胞侵襲和轉移。Jiang等[9]報道，miR-100可通過直接靶向Wnt/β-catenin信號通路的受體卷曲蛋白8(frizzled homolog 8,FZD-8)表達并抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移。

Wnt/β-catenin信號通路是細胞內經典Wnt通路，當受到信號刺激時，糖原合成激酶-3β(glucogen synthase kinase-3β, GSK-3β)失活，β-catenin在細胞質內過量積累，進入細胞核，β-catenin可通過與T細胞因子/淋巴樣增強因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor, TCF/LEF)結合，進而調控下游靶基因的轉錄，在細胞生長、發育和分化過程中發揮重要作用。Wnt/β-catenin信號通路在乳腺癌中異常激活，核內β-catenin活化可引起下游靶基因，如Cyclin D1、原癌基因c-myc、多藥耐藥基因MDR1和轉移相關基因MMP-7等的表達，在乳腺癌發生、轉移和耐藥形成過程中發揮重要作用；抑制Wnt/β-catenin信號通路活化能夠有效抑制乳腺癌細胞生長及對化療藥物耐藥性，被認為是乳腺癌的潛在治療靶點。

TCF4屬于TCF/LEF家族成員，是Wnt信號通路的關鍵因子，在Wnt信號激活時，細胞質內過多的β-catenin進入細胞核，與TCF4結合形成復合物，使其喪失抑制作用，在促轉錄因子作用下，引起下游靶基因過度表達，促進包括結直腸癌、肝癌和胃癌等腫瘤的發生、發展。Huang等[10]在乳腺癌的研究中指出，TCF4是miR-591的靶基因，其表達上調可部分逆轉miR-591對乳腺癌細胞增殖和侵襲的抑制作用。可見，TCF4在乳腺癌的發生、發展過程中亦發揮重要作用。此外，Hong等[11]在結直腸癌的研究中指出，TCF4可通過與E-cadherin轉錄抑制因子Slug結合介導EMT發生。Kendziorra等[12]研究指出，TCF4可能以β-catenin獨立的方式參與直腸癌細胞對5-氟尿嘧啶化療耐藥。

本組前期實驗已證實miR-7-5p和miR-152-3p聯合可通過抑制乳腺癌耐藥MCF-7/TAX的EMT進程降低乳腺癌細胞癌細胞紫杉醇耐藥性，但其具體作用機制尚不明確。本實驗采用生物信息學軟件預測發現，miR-7-5p和miR-152-3p與TCF4 3′UTR均存在互補的結合位點，采用雙熒光素素酶報告基因實驗證實，TCF4是miR-7-5p和miR-152-3p的共同靶標。同時，Western blot法檢測結果發現，miR-7-5p和miR-152-3p表達上調均可引起Wnt/β-catenin信號通路關鍵因子β-catenin、TCF4蛋白表達下調，且兩者聯合具有協同作用。同時，給予Wnt/β-catenin信號通路激活劑處理后，miR-7-5p和miR-152-3p及兩者聯合上調對乳腺癌耐藥MCF-7/TAX的EMT進程及紫杉醇耐藥性的抑制作用明顯減弱。這提示，miR-7-5p和miR-152-3p可能通過聯合靶向調控TCF4使β-catenin/TCF4復合物減少，Wnt/β-catenin信號通路的活化受到抑制，從而使乳腺癌耐藥細胞株EMT進程及紫杉醇耐藥性減弱。

綜上所述，TCF4是miR-7-5p和miR-152-3p的共同靶標，miR-7-5p和miR-152-3p聯合可通過降低TCF4表達抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化，進而抑制乳腺癌耐藥MCF-7/TAX細胞株EMT進程，降低對紫杉醇的耐藥性。該結果從細胞水平上初步闡述了miR-7-5p和miR-152-3p聯合抑制乳腺癌耐藥MCF-7/TAX細胞株EMT進程及紫杉醇耐藥性與Wnt/β-catenin信號通路有關，后期將從體內動物水平上進一步闡述，以期為miR-7-5p和miR-152-3p有望成為改善乳腺癌紫杉醇耐藥性的靶標提供參考依據。