乳腺癌組織和細胞中PIM-1與PD-L1表達水平的相關性分析

劉 慧，馬東慎，劉廣珍，向臣希

乳腺癌為嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一[1]。目前，隨著腫瘤免疫治療的發展，程序性死亡-配體1(programmed death-ligand 1, PD-L1)抑制劑對于難治性乳腺癌的療效初現[2-3]。然而PD-L1的表達具有異質性和動態性[4]，乳腺癌中PD-L1的調控因素尚未明確。促癌因子莫洛尼病毒前病毒整合位點-1(proviral integration site of moloney virus-1, PIM-1)屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶，在免疫系統調節中起重要作用[5]。研究表明PIM-1抑制劑能夠促進三陰型乳腺癌細胞發生凋亡[6]，而PIM-1能否調控三陰型乳腺癌中PD-L1的表達尚未見文獻報道。本文著重分析浸潤性乳腺癌中PD-L1和PIM-1蛋白的表達及兩者表達的相關性，并從細胞學水平初步證明PIM-1對PD-L1蛋白的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010～2016年徐州醫科大學附屬醫院行根治性切除術且術后病理確診為浸潤性乳腺癌患者208例。所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋。根據病理學資料獲得其分子亞型信息，其中Luminal A型43例，Luminal B型47例，HER-2過表達型42例，三陰型76例。按照常規方法制備組織芯片。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP法染色，試劑盒購自北京中杉金橋公司。PIM-1抗體(克隆號G11)購自美國Santa Cruz公司。PD-L1抗體(克隆號22C3)購自美國DAKO公司。免疫組化使用Ventana全自動免疫組化系統進行。PIM-1陽性定位于腫瘤細胞胞核，呈黃色或棕黃色染色，采用免疫組化評分(H-Score)量化PIM-1的表達水平，以中位H-Score作為Cut off值將病例分為PIM-1高表達組和低表達組[7]。PD-L1陽性定位于腫瘤細胞或浸潤的淋巴細胞和巨噬細胞，呈黃色或棕黃色染色。以CPS法對腫瘤PD-L1表達水平進行評分：CPS評分=[(陽性腫瘤細胞+陽性淋巴細胞+陽性巨噬細胞)/活腫瘤細胞總數]×100，統計一個高倍視野下的所有細胞(不少于100個腫瘤細胞)，將CPS評分≥10的病例作為PD-L1陽性病例。所有免疫組化結果均經兩位病理醫師進行評分。

1.2.2細胞培養與轉染 乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，換液及傳代按常規方法進行。PIM-1過表達載體和PIM1小干擾RNA(siPIM-1)由上海吉瑪公司合成。細胞于6孔板分為4組培養，分別為過表達載體對照組、PIM-1過表達組、siPIM-1對照組以及siPIM-1組。培養至70%融合時使用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)按常規方法進行轉染。

1.2.3qRT-PCR 使用PIM-1過表達載體和siPIM-1在乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231中對PIM-1進行過表達或敲減。轉染完畢的各組細胞繼續培養24 h棄去培養上清，每孔加入1 mL Trizol(美國Invitrogen公司)裂解細胞并按常規方法使用氯仿抽提法提取RNA。提取的總RNA使用瓊脂糖電泳檢測完整性并檢測濃度和純度后，使用M-MLV逆轉錄酶(南京諾維贊公司)進行逆轉錄反應。使用AceQ qPCR CYBR Green Master Mix試劑盒(南京諾維贊公司)于StepOne Plus熒光定量qPCR儀中進行qRT-PCR實驗。引物由上海吉瑪公司合成，PD-L1引物序列：上游5′-TGGCATTTGCTGAACG CATTT-3′，下游5′-TGCAGCCAGGTCTAATTGTTTT-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GGAGCGAGATCCCTC CAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT GG-3′。

1.2.4Western blot法 使用PIM-1過表達載體和siPIM-1在乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231中對PIM-1進行過表達或敲減。轉染完畢的各組細胞繼續培養48 h后使用刮刀收取細胞。使用RIPA裂解液(北京碧云天公司)裂解細胞。按常規方法提取蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒(北京碧云天公司)進行蛋白定量并調整蛋白濃度。根據常規方法進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并進行轉膜，使用5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜(PIM-1、PD-L1和GAPDH一抗稀釋比均為1 ∶1 000；PIM-1一抗購自美國Santa Cruz公司，PD-L1、GAPDH一抗購自美國Abcam公司)，次日使用TBST洗滌后二抗室溫孵育1 h，再次洗滌后使用化學發光法檢測目的條帶并使用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

2 結果

2.1 不同分子分型乳腺癌中PD-L1與PIM-1的表達208例乳腺癌根據乳腺癌分子分型分為Luminal A、Luminal B、HER-2過表達和三陰型。免疫組化結果顯示，PIM-1呈胞核著色，PD-L1呈胞質和胞膜著色(圖1)；PD-L1在三陰型乳腺癌中的陽性率為13.16%(10/76)，在Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型中的陽性率分別為4.65%(2/43)、2.12%(1/47)和4.76%(2/42，)，差異有統計學意義(χ2=4.779，P=0.029，表1)。不同分子分型乳腺癌組織中PIM-1表達水平差異無顯著性(χ2=0.432，P=0.511，表2)。

圖1 PD-L1與PIM-1在乳腺癌組織中的表達，SP法：A.1例乳腺癌組織高表達PD-L1；B.該例乳腺癌組織同時高表達PIM-1

表1 不同分子分型乳腺癌中PD-L1的表達[n(%)]

表2 不同分子分型乳腺癌中PIM-1的表達[n(%)]

2.2 乳腺癌組織中PD-L1與PIM-1表達的相關性χ2檢驗結果顯示，PIM-1高表達組中PD-L1的陽性率(12.50%，13/104)高于PIM-1低表達組(1.92%，2/104)。Fisher精確概率法分析顯示，乳腺癌組織中PD-L1與PIM-1的表達呈正相關(P=0.006，表3)。

表3 乳腺癌中PIM-1表達與PD-L1表達的相關性[n(%)]

2.3 PIM-1對乳腺癌細胞中PD-L1表達的影響本組體外實驗顯示，PIM-1對乳腺癌細胞PD-L1表達水平有促進作用。qRT-PCR結果表明，在MCF-7和MDA-MB-231細胞系中，過表達PIM-1顯著提高PD-L1 mRNA水平，敲減PIM-1則導致其表達水平明顯降低(圖2)。Western blot法結果顯示，在MCF-7和MDA-MB-231細胞系中過表達PIM-1明顯提高PD-L1的蛋白表達，敲減PIM-1則導致其表達水平明顯降低(圖3)。

圖2 PIM-1對乳腺癌細胞系中PD-L1 mRNA表達水平的影響：乳腺癌細胞系MCF-7(A)和MDA-MB-231(B)過表達PIM-1明顯促進PD-L1 mRNA表達，敲減PIM-1則明顯降低PD-L1 mRNA表達；*P<0.05，**P<0.01

圖3 PIM-1對乳腺癌細胞系中PD-L1蛋白表達的影響：A.乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231中過表達PIM-1明顯促進PD-L1的表達，敲減PIM-1則明顯降低PD-L1 mRNA表達；B.Western blot條帶的灰度分析結果；**P<0.01，***P<0.001

3 討論

腫瘤免疫治療是近年發展迅速的一種腫瘤治療方法。免疫系統能夠識別腫瘤相關抗原并能夠調控機體內免疫細胞對腫瘤的殺傷，通過修復和增強機體的免疫系統，可以起到抑制腫瘤發生、發展作用[8]。然而，腫瘤在發生、發展過程中會獲得“免疫逃逸”能力，即腫瘤細胞進入免疫抑制狀態，失去對機體的免疫應答。這不僅是腫瘤逃脫免疫監視的原因，也是免疫治療效果不佳的重要原因[9]。引起免疫逃逸的因素很多，在介導腫瘤免疫逃逸的分子中PD-L1最受關注。PD-L1為表達于腫瘤細胞表面重要的免疫抑制分子。腫瘤細胞可通過PD-L1與T細胞表面的PD-1分子結合誘導T細胞的凋亡，從而避免T細胞對腫瘤細胞的殺傷[10]。雖然阻斷PD-L1通路在難治性乳腺癌的治療中已獲得初步成果，但PD-L1在三陰型乳腺癌中的表達具有異質性[11-12]，且并非所有患者均能從PD-L1抑制劑中獲益，因此深入分析PD-L1調控的內在機制，對于尋找新的免疫治療靶點進而解除腫瘤細胞的免疫抑制至關重要。

PIM-1激酶屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶，是促癌因子PIM家族中的一員(PIM-1、2、3)，在免疫系統調節中起重要作用。在病毒誘發的淋巴瘤小鼠模型中發現，PIM-1基因存在病毒基因組的廣泛插入，提示PIM-1的腫瘤驅動作用[13]。PIM-1異常激活與多種血液系統或上皮來源腫瘤相關。PIM家族所有成員基因的敲除并不影響正常細胞活性，故PIM-1正成為新的有潛力的抗腫瘤藥物靶點[14]。泛PIM家族抑制劑已被批準臨床I/II期實驗，用于治療急性骨髓性白血病、難治復發型前列腺癌以及復發型多發性骨髓瘤[15]。此外，有研究結果表明，PIM-1抑制劑能夠促進三陰型乳腺癌細胞發生凋亡[6]。因此，PIM激酶作為乳腺癌治療靶點具有一定的應用前景，值得深入分析。

本實驗使用包含208例乳腺癌患者的組織芯片對PD-L1和PIM-1在乳腺癌組織中表達水平以及相關性進行分析，結果顯示，PD-L1在三陰型乳腺癌中的陽性率高于其它分子分型的乳腺癌，Kruskal-Wallis統計檢驗顯示差異有顯著性。PIM-1在不同分子分型乳腺癌中的表達差異無顯著性。相關性分析顯示，PD-L1與PIM-1的表達水平呈正相關，PIM-1高表達的乳腺癌組織中PD-L1陽性率較高；提示PIM-1對PD-L1的表達具有正向調控作用。本實驗在兩種乳腺癌細胞系MCF-7(ER陽性)和MDA-MB-231(三陰型)中過表達PIM-1或使用siPIM-1敲減PIM-1，qRT-PCR和Western blot法檢測結果顯示，過表達PIM-1明顯促進乳腺癌細胞中PD-L1的表達水平，敲減PIM-1則明顯降低PD-L1的表達水平。對所有乳腺癌病例進行相關性分析和細胞實驗中均未發現PIM-1對PD-L1的正向調控與乳腺癌分子分型相關，PD-L1在三陰型乳腺癌中較高的陽性率可能為其它獨立因素引起。

本實驗在乳腺癌組織中初步證明了PD-L1與PIM-1表達水平間存在正相關，并進一步在乳腺癌細胞株上驗證了PIM-1對PD-L1表達的促進作用，提示PIM-1可正向調控PD-L1的表達。臨床上乳腺癌免疫療法作為靶向用藥和化療的補充療法得到極大的關注。深入揭示乳腺癌組織中PD-L1的表達調控機制，為以PIM-1為靶點開發腫瘤免疫治療藥物提供了理論基礎。