肺腺癌組織中TCF21、VEGF表達與微血管密度及預后的相關性分析

婁 寧，楊 帆，王莉芝，蔡仁萍，解麗梅

肺癌是發病率和病死率最高的惡性腫瘤，近年來其發病率呈上升趨勢，患者長期預后差，5年生存率不足20%[1-2]，大多數患者就診時腫瘤已進展為中晚期，部分患者甚至發生遠處轉移，而腫瘤血管生成是肺癌浸潤和轉移的關鍵因素[3]。近年來發現腫瘤轉移相關基因轉錄因子21(transcription factor 21, TCF21)參與多種惡性腫瘤的發生、發展和轉移，如在結腸癌、腎癌等組織中作為潛在的抑癌基因通過抑制腫瘤血管生成發揮生物學作用[3-4]，然而其在肺癌中的作用機制尚未見報道。本實驗通過分析肺腺癌組織中TCF21、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達與微血管密度(microvessel density, MVD)及預后的相關性，旨在對其致病機制、疾病預后等方面的研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016年1月～2017年12月山東第一醫科大學附屬萊鋼醫院病理科存檔的91例肺腺癌及癌旁組織(距離腫瘤邊緣>2 cm)，均經病理學明確診斷。納入標準：(1)術前未接受任何治療(過放、化療、免疫治療或靶向治療)；(2)臨床和病理資料保存完整；(3)未合并其他類型的惡性腫瘤。患者平均年齡62.1歲(范圍37～79歲)；其中男性55例，女性36例；年齡≤60歲者41例，>60歲者50例。腫瘤直徑≥3 cm者46例，<3 cm者45例。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期34例，Ⅲ+Ⅳ期57例；有淋巴結轉移者43例，無淋巴結轉移者48例。所有標本的使用均經患者知情同意，本實驗經山東第一醫科大學附屬萊鋼醫院倫理委員會批準。

1.2 免疫組化標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，常規HE染色。免疫組化：確診的肺腺癌石蠟標本，4 μm厚連續切片，65 ℃烤2.5 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，待微波爐內的枸櫞酸鈉(pH 6.5)緩沖液沸騰后，抗原修復10 min，室溫下復溫。3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，山羊血清封閉非特異性位點，加入一抗，4 ℃恒溫過夜。用PBS溶液代替一抗作為陰性對照。室溫復溫、洗滌后加入二抗、辣根酶標記鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木精復染、脫水、透明、封膠。TCF21(購自華安生物公司)以細胞核呈棕黃色為陽性，VEGF、CD34(購自北京中杉金橋公司)以細胞質呈棕黃色為陽性。染色結果由兩位病理醫師采用雙盲法各自獨立評判，采用半定量法結合染色強度和染色范圍評判表達結果。根據陽性細胞百分數計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。根據細胞染色強度計分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述兩項得分結果相乘：0～2分為陰性，3～12分為陽性。

1.3 MVD計數采用Weidner法，用CD34標記腫瘤微血管內皮細胞，陽性呈淺棕色至深棕色。首先于顯微鏡低倍鏡下在腫瘤間質內尋找微血管密集區域，然后用高倍鏡計數5個視野的微血管數，取其平均值為MVD值。計數標準：任何可被染成棕黃色呈陽性的血管內皮細胞或內皮細胞簇，與鄰近血管、腫瘤細胞或其他組織之間存在明顯分隔的視為1個微血管。所有切片均采用雙盲法閱片。

1.4 隨訪91例患者隨訪3～36個月，22例存活，5例失訪，64例死亡，隨訪截至2020年12月31日。

2 結果

2.1 肺腺癌及癌旁正常組織中TCF21、VEGF的表達肺腺癌分化較好時常可見腺樣結構(圖1)。TCF21表達于細胞核，著色為淡黃色(圖2)、棕褐色(圖3)等。VEGF主要表達于細胞質，著色為棕褐色(圖4)、淡黃色(圖5)等。TCF21、VEGF在肺腺癌組織中的陽性率分別為45.1%(41/91)和60.4%(55/91)；在癌旁正常組織中的陽性率分別為90.0%(27/30)和0；TCF21在肺腺癌組織中的陽性率明顯低于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)；VEGF在肺腺癌組織中的陽性率明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 TCF21、VEGF表達及MVD與肺腺癌臨床病理特征的關系TCF21、VEGF表達及MVD與肺腺癌分化程度、淋巴結轉移、TNM分期相關，差異有統計學意義(P<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤直徑均無相關性，差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 肺腺癌中TCF21、VEGF表達及MVD與臨床病理特征的關系

2.3 肺腺癌組織中TCF21、VEGF表達及MVD值的相關性91例肺腺癌組織中TCF21陽性41例，陰性50例；VEGF陽性55例，陰性36例；兩者均陽性10例，均陰性5例，TCF21陽性+VEGF陰性者31例，TCF21陰性+VEGF陽性者45例。Spearman相關性分析結果顯示，肺腺癌組織中TCF21與VEGF的表達呈負相關(r=-0.668，P<0.05)。TCF21表達與MVD值呈負相關(r=-0.542，P<0.05)；VEGF表達與MVD值呈正相關(r=0.468，P<0.05)。TCF21陽性組MVD值顯著低于陰性組，VEGF陽性組MVD值明顯高于陰性組，差異均有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 肺腺癌中TCF21和VEGF表達與MVD值的關系

2.4 肺腺癌組織中TCF21、VEGF表達及MVD值與患者預后的關系應用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，TCF21陰性組患者的生存期明顯低于陽性組，Log-rank檢驗顯示，兩組間差異有統計學意義(χ2=10.733，P=0.001)。VEGF陰性組患者的生存期明顯高于陽性組，Log-rank檢驗顯示，兩組間差異有統計學意義(χ2=11.380，P=0.001)。MVD值取中位數，高于中位數為高表達，低于中位數為低表達，MVD高表達組患者的生存期明顯低于低表達組，Log-rank檢驗顯示，差異有統計學意義(χ2=19.017，P<0.001，圖6)。

圖6 Kaplan-Meier生存曲線分析：A．TCF21表達與肺腺癌患者預后的關系；B．VEGF表達與肺腺癌患者預后的關系；C．MVD表達與肺腺癌患者預后的關系

3 討論

TCF21屬于堿性螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix proteins, BHLH)家族的a類成員，被認為是一種腫瘤抑制因子。鄧俊宇[5]的研究結果顯示，TCF21在結直腸癌組織中低表達，在結直腸癌的發生、發展中可能起腫瘤轉移抑制作用。張輝等[6]應用RNA干擾技術沉默腎癌Caki-1細胞中TCF21基因的表達，KISS-1蛋白表達顯著下調，進而抑制腫瘤浸潤轉移。另有研究發現食管癌組織中TCF21 mRNA和蛋白表達均低于癌旁正常組織，TCF21低表達與TNM分期密切相關且患者預后較差[7]。本實驗結果顯示，TCF21在肺腺癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織，與上述研究結果吻合。然而在肺腺癌組織中VEGF表達水平及MVD值明顯高于癌旁正常組織，與TCF21表達呈負相關，提示TCF21低表達可能與肺腺癌發生、發展有關，是一個腫瘤抑制因子，可能與其抑制腫瘤血管生成有關。本實驗結果顯示，TCF21表達水平與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM分期相關。生存曲線顯示，肺腺癌組織中TCF21低表達，患者生存率下降。這表明TCF21表達與肺腺癌患者預后呈負相關，其主要機制可能與抑制血管生成有關。

腫瘤血管生成機制一直是腫瘤轉移研究的關鍵因素之一[8-9]。近年來文獻報道，VEGF是血管生成的有效誘導劑，通過激活其下游信號分子，可影響血管內皮細胞的增殖、遷移、侵襲，從而促進血管生成，促進腫瘤進展[10]。CD34可標記新生血管內皮細胞，常作為腫瘤MVD的標志物，目前已將MVD作為評估腫瘤血管形成的重要標準。癌組織中TCF21低表達，是否與腫瘤血管生成相關尚未見報道，本實驗進一步深入探討。TCF21在膽管癌組織或細胞系中顯著下調，促進了腫瘤的生長或體內腫瘤相關的血管生成，導致VEGF過表達和分泌。在細胞試驗中，TCF21的高表達顯著降低了內皮細胞的活力、遷移和管的形成。因此，TCF21可抑制膽管癌腫瘤血管生成[11]。過表達TCF21可抑制質粒轉染人乳腺癌細胞系MDA-MB-231的侵襲、遷移和血管生成，促進腫瘤細胞凋亡，VEGF蛋白表達明顯降低。因此TCF21可能抑制細胞的血管生成和凋亡[12]。本實驗相關性分析結果表明，TCF21表達與VEGF表達及MVD值呈負相關。低表達的TCF21可能促進腫瘤組織中血管的生成，其可能是腫瘤血管生成的抑制因子，這與文獻報道的結果一致。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉移的基礎，VEGF表達及MVD值與肺腺癌患者年齡、性別及腫瘤直徑無相關性，與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM分期相關，與Li等[11]的結果一致。

TCF21可能在肺腺癌的血管生成中發揮重要作用，為肺腺癌的治療提供新的預測指標和靶點；TCF21、VEGF、CD34均與患者預后有相關性，聯合檢測可作為肺腺癌惡性程度的評判指標。