六胺銀滴染法在真菌檢測中的應用

王 琦，吳海波，許璐璐，鐘 文，王月娥，王曉秋，顧 萍

六胺銀染色是特殊染色中常用的真菌檢測方法之一，其敏感性高且能夠清晰的顯示真菌的形態，是組織病理學檢測真菌的重要手段[1]。以往六胺銀染色多采用高身5片立式染缸浸染法，但該方法浪費試劑，并且受染色缸清潔度的影響，易出現銀鏡反應和銀沉淀污染[1-2]。本科室采用了一種滴染法，效果穩定，且可節省試劑，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)2018年以來病理診斷為真菌感染的標本120例，其中鼻腔及鼻竇組織68例，肺部穿刺活檢及手術標本35例，耳部及角膜組織15例，皮膚組織2例。所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規脫水透明，石蠟包埋，4 μm厚連續切片。六胺銀染色試劑盒購自珠海貝索生物公司，成分包含高碘酸、六次甲基四胺銀粉劑、硼砂溶液、硫代硫酸鈉和伊紅染液。使用前將六次甲基四胺銀粉劑與硼砂溶液1 ∶1混合，徹底混勻試劑。

1.2 方法

1.2.1立式染缸浸染法 將混勻后的六胺銀工作液倒入立式染缸內，60 ℃加熱30～60 min，終止染色后水洗，硫代硫酸鈉染色2 min，伊紅復染。

1.2.2滴染法 將混勻后的六胺銀工作液滴加到玻片上，完全覆蓋組織，并將玻片置于濕盒內，放入恒溫烤箱，65 ℃加熱30～50 min，期間適時觀察組織的顏色變化，待組織呈深黃色，鏡下觀察真菌呈黑褐色時，終止染色，水洗，硫代硫酸鈉染色2 min，伊紅復染(表1)。

表1 兩種六胺銀染色方法步驟對比

1.3 統計學分析采用SPSS 26.0軟件進行統計學處理，兩組間差異采用χ2檢驗進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 染色結果對比120例標本中，霉菌99例，隱球菌19例，組織胞質菌1例，諾卡菌1例。兩種染色方法均能顯示這些真菌，真菌菌體呈黑色，背景呈紅色(圖1、2)。其中浸染法119例陽性，滴染法118例陽性，兩種染色法陽性率基本一致，差異無統計學意義(P>0.05)，證明滴染法具有可行性(表2)。

圖1 A.六胺銀浸染法顯示霉菌，菌絲呈黑色，可見分支和橫隔，形態清晰可辨；B.六胺銀滴染法顯示霉菌，菌絲呈黑色，可見分支和橫隔，形態清晰可辨，與浸染法結果基本一致 圖2 A.六胺銀浸染法顯示新型隱球菌，圓形或橢圓形，菌壁深黑色，菌體中間淡染，形態清晰可辨；B.六胺銀滴染法顯示新型隱球菌，圓形或橢圓形，菌壁深黑色，菌體中間淡染，形態清晰可辨，與浸染法染色結果基本一致

表2 兩種染色方法陽性病例數統計分析

2.2 工作成本以試劑盒為例，高身5片立式染缸浸染每次需工作液約50 mL，一般染5張切片，平均每張切片需工作液約10 mL，成本約為25元/張；滴染法每張切片最多需要2 mL工作液，成本小于5元/張，滴染法成本明顯低于浸染法。

3 討論

隨著病理技術的發展，病理質量控制的要求越來越高。以往HE染色大多采用浸染法，存在染液褪色、染液被污染等缺點，現在越來越多的科室開始使用全自動滴染機，染色均一，且不受其他切片的影響，效果良好，易質控[3-5]。滴染能夠有效的改善染色問題，滿足質控的要求，這同樣也適用于特殊染色。徐明堂等[6]將脂肪染色由浸染法改為油紅滴染法，不僅操作相對簡便，且可節省試劑。除此之外，對于一些疑似微生物感染的細胞學標本，滴染還可以更好的減少交叉污染。目前，市場上雖然有采用滴染的全自動特殊染色儀，但染色成本較高，阻礙了其推廣和發展[7-8]。

近年來真菌感染逐漸增多，由于HE染色不易診斷，有時需借助特殊染色，其中六胺銀染色是組織病理學檢測真菌感染的重要方法之一。其原理是利用氧化劑氧化真菌菌壁暴露出醛基，醛基與銀氨液反應，使菌壁呈現黑色。六胺銀染色過程需要加熱，以往的浸染法受熱均勻，染色均一，但試劑浪費較多，特別是對于使用商品化試劑盒來說，如果使用立式染缸浸染，配制好的工作液(約50 mL)只能單次使用，平均到每張切片的試劑量約為10 mL(以5片裝滿計算)，消耗較多，成本較大。很多基層科室真菌感染樣本量不是很多，很難單次達到5張切片，為節省成本，通常將多天樣本累積到一起進行染色，嚴重影響了病理報告的時間。本實驗采用的滴染法是將六胺銀工作液覆蓋玻片上的待測組織，并置于濕盒內。實踐發現，這些試劑基本上不會揮發，并且單個切片試劑用量最多不超過2 mL，從而節省了大量試劑。濕盒放入恒溫烤箱內，期間可隨時觀察組織的顏色變化，至組織呈深黃色，鏡下觀察菌壁呈黑褐色時，可終止染色。六胺銀滴染法和浸染法所用試劑的成分沒有改變，只是對染色方法作了調整，兩種染色法的陽性率基本一致。本組120例中，118例兩組染色結果均為陽性，1例為陰性，僅1例結果不同，該例為活檢組織，對比HE和兩種六胺銀染色發現，組織含真菌部分過少，多次切片后含菌部分被切完，導致結果差異。1例陰性樣本前期PAS染色結果陽性，這也提醒醫師診斷真菌感染時，六胺銀和PAS染色有一定的互補性，同時使用可提高真菌的檢出率。另外，本實驗發現，滴染法無需接觸染缸等易致銀沉淀產生的玻璃器皿，染色切片一般較干凈，組織周邊無黑色沉淀污染。

在滴染的過程中需注意以下幾點：(1)染液要完全覆蓋組織，防止邊緣干片；(2)滴染溫度比經典Gomori法溫度稍高，以保證濕盒內的溫度；(3)若想加快染色速度，可升高烤箱溫度，但必須注意溫度過高會導致染色較快，不夠緩和，容易過染和出現假陽性。染色過程最好能用顯微鏡觀察；(4)染色結束后，取出玻片，應立即沖洗，防止染液冷卻，造成玻片沖不干凈；(5)每張切片必須配置陽性對照，一方面可檢驗染色流程的準確性和染液的有效性，另一方面可以為觀察染色程度提供參考；(6)混合后的六胺銀工作液可在4 ℃環境下存放1個月，使用前應注意觀察染液的顏色，若染液變渾濁或發黃，說明染液變質，不能繼續使用。

總之，六胺銀兩種染色方法均可顯示真菌形態，滿足臨床病理診斷的需求，但滴染法不受切片之間染色的影響，滿足了質控的要求，另外還能夠節省試劑，降低成本，并且可隨時染色，為報告的出具節省時間，值得推薦。