石蠟包埋中骨髓標準化脫鈣的應用

沈吟芳，王 謙，郭凌川

骨髓活檢是用一支特制的穿刺針在患者髂前上棘或髂后上棘處取出1.0～2.0 cm長、直徑0.1～0.2 cm的圓柱形骨髓。骨髓富含鈣鹽、一定量的脂肪及少許纖維支架，具有組織小而硬、脆、松的特點，必須經過脫鈣后才能進行石蠟包埋，制成骨髓切片。本實驗經過長期實踐，總結出一套骨髓標準化脫鈣處理方法，操作安全簡便，不僅制成了高質量的石蠟切片，而且在HE染色、網狀纖維染色及免疫組化標記中，均取得了滿意的效果，現將方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年6月～2020年2月蘇州大學附屬第一醫院血液科送至病理科的骨髓活檢標本1 775例。

1.2 試劑固定液：35%～40%甲醛100 mL，無水磷酸氫二鈉6.5 g，磷酸二氫鈉4.0 g，蒸餾水900 mL；復合脫鈣液：甲酸120 mL，36%～38%鹽酸80 mL，蒸餾水800 mL。

1.3 方法(1)從患者體內穿刺出骨髓后立即放入固定液中密閉固定，固定液的用量是骨髓體積的5～10倍，送至病理科后固定12～24 h；(2)12～24 h后開始取材，骨髓組織迅速脫鈣，在裝滿脫鈣液的棕色玻璃瓶內，室溫(20 ℃左右)避光密封脫鈣1～3 h，脫鈣液的用量是骨髓組織體積的30倍，完全脫鈣的骨髓組織放入固定液中繼續固定1～3 h，與其它常規標本一起進入全自動脫水機內，按工作日程序進行脫水、透明、浸蠟；(3)第3天開始石蠟包埋、切片、HE染色(切片厚2 μm[1])，鏡下閱片，初步診斷；(4)第4天，根據初步診斷的需求，繼續骨髓石蠟切片，切出3 μm厚[2]的切片，進行Gomori網狀纖維染色；切出2 μm厚[1]的切片，操作步驟嚴格按免疫組化試劑盒說明書進行，DAB顯色。

2 結果

骨髓石蠟切片完整無刀痕、光滑平整，厚薄均勻一致。HE染色顯示骨髓形態結構全面，細胞核與細胞質紅藍適度，對比度好(圖1)；網狀纖維染色中粗細網狀纖維清晰，背景干凈(圖2)；免疫組化染色顯示核抗原、漿抗原和膜抗原均表達良好，陽性信號定位準確清楚(圖3)。

3 討論

骨髓通過標椎化脫鈣，保存了完整的細胞形態結構，保留了細胞膜、細胞質、細胞核抗原，進行HE染色及免疫組化標記等檢測結果均可靠準確，為白血病、漿細胞瘤等血液疾病診斷和鑒別診斷提供技術上的支持，并且可以判斷轉移癌、淋巴瘤等的骨髓浸潤情況從而引導臨床為患者進行有效地精準治療。標準化脫鈣處理中固定液及脫鈣液的選擇、用量的多少、時間的長短及終止脫鈣后的處理等均是關鍵因素：(1)骨髓取材前，必須及時充分固定并在密閉容器內進行，防止固定液揮發對人體造成刺激。骨髓固定與脫鈣不能同步進行[3]，因為在沒有正確固定之前，脫鈣液就開始破壞組織結構，引起蛋白質缺失，直接影響病理診斷的正確性。固定液選用10%中性緩沖福爾馬林，固定均勻，滲透力強，甲醛與蛋白質的氨基結合，凝固蛋白質，保持免疫活性。骨髓組織立即放入固定液中固定；固定液的用量是骨髓體積的5～10倍[4]；固定時間要充分，確保固定12～24 h。只有在取材前骨髓組織給予正確固定，才能保持組織結構完整，保存蛋白質抗原。(2)骨髓組織脫鈣應在室溫下1～3 h內完成充分脫鈣，短時間內低濃度的酸處理，對細胞質和細胞核染色影響小[5]。脫鈣液未選用優良的脫鈣液乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，因其價格昂貴，脫鈣溫和但作用緩慢；也未選擇最常用的脫鈣劑硝酸[6]，硝酸對骨髓結構破壞較大。10%硝酸脫鈣速度快，但會造成蛋白質抗原的缺失，特別是對核陽性的抗原降解最明顯，造成假陰性[7]。本實驗選用的是復合脫鈣液，其中甲酸作用較慢，使骨髓組織膨脹、脂質溶解、促進鹽酸均勻滲入到骨髓組織內，快速溶解堅硬的鈣鹽。每天脫鈣前必須更換新鮮的復合脫鈣液，脫鈣液的用量應是骨髓體積的30倍[8]，在密閉容器內進行脫鈣，以減少脫鈣液的揮發。當骨髓組織密度相同，長度不同時，一般1.0 cm長的骨髓組織脫鈣時間約1 h，1.5 cm長的骨髓組織脫鈣時間為1.5 h，2.0 cm長的骨髓組織脫鈣時間為2.0 h，目前為止，最硬最長的骨髓組織在室溫下約3 h便可徹底脫鈣。脫鈣時間太短，骨髓切片時有刀痕，易損壞刀片；脫鈣時間過長，易脫片，HE染色顯示不佳，免疫組化染色出現假陰性。判斷脫鈣是否成功，可用手捏骨髓組織，無硬感；用手指掐，骨髓組織能彎曲、富有彈性為脫鈣成功。復合脫鈣液在室溫短時間內的脫鈣處理，最大限度的保留組織抗原[9]，對抗原無影響。(3)脫鈣成功的骨髓組織，應繼續放入固定液中再固定1～3 h。脫鈣1 h的骨髓組織，繼續固定約1 h；2 h脫鈣的骨髓繼續固定約2 h。充分脫鈣后的骨髓再固定，稀釋中和組織內的各種酸性液體，消除各種酸性液體的破壞作用，同時繼續保證組織結構的完整性及抗原物質的有效性。本實驗在常規取材工作中，骨髓在室溫下3 h內完成脫鈣，脫鈣后再固定3 h的期間內，其它常規標本正在有序取材，待取材結束，骨髓標準化脫鈣處理也恰好完成，體現出高效率的工作流程。在進行骨髓標準化脫鈣中，同時做好自身的防護和周圍環境的保護。本實驗在我科負二樓污染區的取材室內完成取材、脫鈣、脫水等一系列組織處理；在三樓半污染區的切片室內完成石蠟包埋、切片、染色出片。近年文獻[5]報道表面脫鈣法逐步應用于骨髓制片中，脫鈣時間短，效果好。表面脫鈣法即“包埋后脫鈣”[9]，固定不脫鈣的骨髓組織先石蠟包埋，在蠟塊粗修暴露出組織最大面后，再把蠟塊浸泡在脫鈣液中脫鈣，脫鈣完成后及時切片。后脫鈣法在切片室進行脫鈣處理，更應謹慎操作，避免酸性脫鈣液的揮發，造成人體傷害及腐蝕儀器等意外事件發生。

綜上所述，本實驗通過骨髓標準化脫鈣處理，高效地制成高質量的石蠟切片，有利于病理組織學圖像的觀察及抗原表達的分析，更有助于做出精準的診斷、預后判斷及治療方案。目前，骨髓標準化脫鈣處理獲得江蘇省血液研究所專家們的認可，已在血液研究所骨髓病理檢查室的日常工作中推廣運用。如今國內已有相關文獻報道，運用進口酸類脫鈣劑RapidCal[7]，能較好保存蛋白質和DNA；國外也有文獻[10]報道，使用EDTA脫鈣劑亦獲得良好的抗原及理想的DNA含量，本實驗亦從骨髓內取得了達到分子檢測要求的核酸含量及質量，但例數不足，隨著分子檢測的實例不斷增多，本實驗后期會不斷完善骨髓標準化脫鈣，最終會達到甚至超越進口脫鈣液及EDTA脫鈣的優勢，從組織內提取出優質且量多的染色質，進行分子檢測。