基于CRISPR/Cas9技術構建Atg7基因敲除的人腦微血管內皮細胞系

李雯卉， 劉輝， 李澤燁， 韋佳祎， 陳譽華

血腦屏障是中樞神經系統的一個獨特結構，它緊密地控制著離子、分子、細胞在血管和腦之間運動[1]。血腦屏障的屏障特性是使神經組織免受毒素和病原體的侵襲，對中樞神經系統穩態的維持至關重要[1-2]。腦微血管內皮細胞是血腦屏障重要的細胞組分，它在血腦屏障的建立以及功能發揮中起關鍵作用[3-4]。許多研究還發現腦微血管內皮細胞的功能障礙與很多腦血管相關疾病有緊密的聯系[5-9]。1992年，Atg7因其在酵母自噬中發揮重要作用而開始被關注[10]，隨后它一些新的功能也陸續被研究者發現。近來有研究發現小鼠內皮細胞敲除Atg7能減弱動脈血栓的形成[11]，我們的前期研究也發現，小鼠內皮細胞敲除Atg7不利于腦血管的形成[12]。然而，Atg7在腦血管和參與血腦屏障形態建成的機制尚不清楚。CRISPR/Cas9系統是細菌和古細菌形成的一種免疫防御系統，近年來經人為改造后廣泛應用于基因編輯，其原理是通過單一引導RNA序列(sgRNA)識別特定靶DNA序列，將內切酶Cas9引導至靶DNA的設定位置進行切割，使DNA雙鏈斷裂，細胞在通過自身非同源性末端修復時，可使目標區域DNA出現插入、缺失等改變，達到基因敲除或改造的目的[13]。我們利用CRISPR/Cas9技術在體外構建Atg7基因敲除的人腦微血管內皮細胞，為Atg7在腦血管的發育和參與血腦屏障形態建成的機制以及腦血管相關疾病的深入研究提供體外細胞模型。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人腦微血管內皮細胞(human brain microvascular endothelial cells，HBMEC)(美國Johns Hopkins大學醫學院K.S.Kim教授贈送)；1640培養液、胎牛血清、胰酶、嘌呤霉素(Gbicol，美國)；NU血清(BD，美國)；殺稻瘟菌素、atg7抗體(Sigma，美國)；H5450 pLenti-CMV-Puro-P2A-3Flag-espCas9_1.1；H6804 pLenti-U6-spgRNAv2.0-CMV-Blasticidin質粒；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase；TaKaRa TaqTMVer. 2.0 plus dye；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0；和元無縫克隆試劑盒；DH5α感受態細胞；luria-bertani(LB)培養基；AxyPrep質粒DNA小量試劑盒；無內毒素質粒大提試劑盒(天根生化科技有限公司，DP117，北京)；TRNzol Universal總RNA提取試劑(天根生化科技有限公司，DP424，北京)；FastKing RT Kit(With gDNase)(天根生化科技有限公司，KR116，北京)；熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)(天根生化科技有限公司，FP209，北京)；放射免疫沉淀測定細胞裂解液(碧云天，美國)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、冷凍高速離心機(Thermo Fisher，美國)；β-actin單克隆抗體(中杉金橋，中國)；山羊抗鼠HRP酶標二抗(賽默飛世爾，中國)；DNA電泳槽、穩壓電泳儀(上海天能科技有限公司)；凝膠成像分析儀(培清科技)；超微量分光光度計(北京奧凱科技發展有限公司)；移液器(Eppendorf，德國)；電熱恒溫水槽、隔水式恒溫培養箱、恒溫振蕩器(上海一恒科學儀器有限公司)，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀(Applied biosystems，美國)；7500 Real Time PCR擴增儀(ABI，美國)；雙光子激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，德國)。本研究的引物合成，sgRNA的合成以及病毒包裝均由和元生物技術股份有限公司完成。

1.2 sgRNA的設計和合成 利用CRISPR在線設計工具(http：//crispr.mit.edu)，在人Atg7基因(GeneID:10533)的第一個外顯子設計2對sgRNA(表1)，分別為sgRNA1(針對的靶點序列AGA AGA AGC TGA ACG AGT ATC GG)、sgRNA2(針對的靶點序列TAG GGT CCA TAC ATT CAC TGA GG)；分別在sgRNA的正義鏈(F)的5’端添加ACCG、反義鏈(R)的5’端添加AAAC形成黏性末端，可與BsmBI酶酶切后的黏性末端互補。

表1 CRISPR/Cas9敲除HBMEC Atg7基因sgRNA引物序列

1.3 重組真核表達載體H6804-sgRNA的構建 使用限制性內切酶BasmBI對表達載體H6804進行酶切，酶切反應體系為：質粒2 μg，10×反應Buffer 5 μL，限制性內切酶1 μL，用水補足50 μL，于37 ℃水浴鍋中孵育2 h以上。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，從瓊脂糖凝膠電泳切割目的載體條帶，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收，得到質粒H6804的線性載體。使用無縫克隆試劑盒將sgRNA與H6804的線性載體連接，構建重組真核表達載體H6840-sgRNA1(Y7541)和H6840-sgRNA2(Y7542)，分別將它們轉化到DH5α感受態細胞，將感受態細胞均勻涂到含氨芐青霉素的LB瓊脂培養基平板上，37 ℃恒溫培養箱中過夜培養，第二天挑取單菌落，搖菌培養后進行菌落PCR，菌落鑒定得到的陽性克隆，送測序公司進行測序驗證，正向測序引物hU6-F2 TAC GAT ACA AGG CTG TTA GAG AG，反向測序引物pY-SEQR CTA TTA ATA ACT AAT GCA TGG C。軟件比對測序結果并分析。測序通過的陽性克隆，安排質粒小提并進行雙酶切再一次驗證。

1.4 HBMEC的培養以及嘌呤霉素及殺稻瘟菌素篩選濃度的確定 用NU培養基(含10%NU血清、10%胎牛血清和細胞生長所需營養成分的1640培養液)培養細胞。取處于對數生長期的細胞接種于96孔板，每孔接種1.5×105的細胞量，第二天分別用嘌呤霉素濃度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20 mg/L的NU培養基或殺稻瘟菌素濃度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20 mg/L的NU培養基替換舊的培養基。每個抗生素的每個濃度都設置3個復孔，總共72個孔。每天觀察細胞的生長情況，選擇7 d使細胞全部死亡的最小濃度作為它們的篩選濃度。最后確定嘌呤霉素的篩選濃度為1 mg/L，殺稻瘟菌素的篩選濃度為3 mg/L。

1.5 慢病毒包裝和感染HBMEC以及敲除Atg7基因的HBMEC的單克隆篩選 H5450 pLenti-CMV-Puro-P2A-3Flag-espCas9_1.1、H6840-sgRNA1(Y7541)和H6840-sgRNA2(Y7542)三個真核表達載體分別和包裝質粒共轉染293T細胞，在293T細胞中進行慢病毒包裝。之后對包裝好的病毒進行滴度檢測。培養HBMEC，取對數生長期的細胞接種于2個35 mm培養皿，每個皿接種5×105的細胞量，第二天其中一個培養皿加入Cas9病毒，所加病毒量根據病毒滴度、細胞量和選擇的感染復數(multiplicity of infection，MOI)值計算[病毒量(μL)=MOI×感染時的細胞數/滴度(TU/mL)×1 000]。病毒感染12～16 h后更換為新的NU培養基。另一個培養皿不加病毒，作為加Cas9病毒的對照組。待細胞長滿后進行細胞傳代，Cas9病毒感染的細胞傳至4個35 mm培養皿，分別編號為1、2、3、4，用含1 mg/L嘌呤霉素的NU培養基培養。未感染Cas9病毒的正常HBMEC統一保留一個35 mm培養皿，編號為5，用正常的NU培養基培養。4號和5號培養皿中細胞長滿之后，用來提取蛋白質，通過蛋白免疫印跡實驗檢測Cas9。1號和2號培養皿中分別加入H6840-sgRNA1(Y7541)和H6840-sgRNA2(Y7542)病毒感染細胞，感染過程與Cas9病毒感染細胞相同。感染48 h后消化離心收集細胞，重懸細胞計數，通過有限稀釋法最后把細胞接種于96孔板，每孔接種1個細胞，各接種48個孔，進行單克隆篩選。接種96孔板后剩下的細胞傳至60 mm培養皿繼續培養，此時的培養液用含1 mg/L的嘌呤霉素和3 mg/L的殺稻瘟菌素的NU培養基，待細胞長滿后凍存備用。96孔板中細胞第二天也換成1 mg/L的嘌呤霉素和3 mg/L的殺稻瘟菌素的NU培養基。每天觀察孔中細胞的生長情況，并做好標記。培養5 d后每隔1天對有細胞的孔進行換液，大約14 d后待孔中細胞長滿之后，轉移至24孔板中，繼續擴大培養后依次傳至6孔板、培養瓶中。對挑選出來的單克隆細胞都仔細做好標號。3號培養皿中的細胞(只感染了Cas9病毒的細胞，HBMEC-cas9)繼續擴大培養，凍存一部分，其作為我們挑選出來的單克隆細胞(HBMEC-atg7KO)的對照細胞。

1.6 HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7 mRNA的檢測 采用實時熒光定量PCR檢測Atg7 mRNA的相對表達量。收集HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO,通過TRNzol Universal總RNA提取試劑提取細胞的總RNA，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增，檢測細胞的Atg7 mRNA。引物序列見表2。反應條件為：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸32 s，擴增40個循環。以GAPDH為內參，根據2-△△Ct計算Atg7的mRNA相對表達量。△△Ct=(CT實驗組目的基因-CT實驗組內參基因)-(CT對照組目的基因-CT對照組內參基因)。

表2 人Atg7基因和GAPDH基因引物序列

1.7 蛋白免疫印跡實驗檢測HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7蛋白 采用蛋白免疫印跡實驗檢測Atg7蛋白，以β-actin作為內參。收集HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，用含苯甲基磺酰氟蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀測定細胞裂解液在冰上裂解細胞，裂解30 min后用細胞刮收集到離心管中，4 ℃離心機12 000 r/min離心15 min(離心半徑20 cm)，上清液即為提取的蛋白質。通過BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，加入5×蛋白上樣緩沖液制成蛋白樣，制成的蛋白樣99 ℃加熱5 min。之后即可進行電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；加一抗(Atg7 1∶1 000；β-actin 1∶2 000)4 ℃孵育過夜，第二天Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜3×10 min，二抗(1∶8 000)室溫孵育1 h，Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜3×10 min，化學發光，觀察蛋白的表達情況。

1.8 細胞免疫熒光染色檢測HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7蛋白 分別將HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO接種于孔中已提前放好蓋玻片的6孔板中，各孔接種2×105的細胞量，細胞培養箱中培養1 d后取出細胞進行染色。去除培養基，用PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛室溫固定10 min；固定后用預冷的PBS搖床上清洗3次，每次5 min；用0.1%的Triton X-100室溫透化處理1 min，預冷的PBS搖床上清洗3次，每次5 min；加入1%的牛血清白蛋白室溫封閉1 h；封閉結束后加入鼠抗人Atg7一抗(1∶100,用1%牛血清白蛋白稀釋)，4 ℃孵育過夜；第二天用預冷的PBS搖床上清洗3次，每次5 min；加入Alexa Fluor 488標記的山羊抗鼠二抗(1∶200,用1%牛血清白蛋白稀釋)，室溫孵育1 h；1 h后用預冷的PBS搖床上清洗3次，每次5 min，之后進行細胞核染色(1 g/L的4’6-二脒基-2-苯基吲哚(4'6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)用PBS按1∶1 000稀釋)，染色3 min；預冷的PBS搖床上清洗3次，每次5 min；加入防淬滅的封固劑進行封固，共聚焦顯微鏡照相觀察。

1.9 顯微鏡下觀察細胞形態 在35 mm培養皿中培養正常HBMEC、HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO，在倒置顯微鏡下觀察3種細胞的形態，并拍照記錄，分析敲除Atg7后細胞形態是否出現變化。

2 結果

2.1 重組真核表達載體H6804-sgRNA的構建情況 各挑取8個含重組真核表達載體H6804-sgRNA1(Y7541)或H6804-sgRNA2(Y7542)的單菌落搖菌后進行菌落PCR擴增，均可見清晰條帶。同時基因測序結果發現，重組真核表達載體H6804-sgRNA1相對質粒H6840插入了一段序列,sgRNA1-F序列一致；重組真核表達載體H6804-sgRNA2相對質粒H6840插入了一段序列,與sgRNA2-R序列一致。以上結果表明，重組真核表達載體H6804-sgRNA1、H6804-sgRNA2構建成功。見圖1。

圖1 重組真核表達載體H6804-sgRNA的構建

2.2 實時熒光定量PCR檢測HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7 mRNA的相對表達 通過實時熒光定量PCR實驗檢測Atg7的mRNA，結果顯示，Atg7基因敲除的HBMEC Atg7 mRNA的表達量明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7 mRNA的相對表達

2.3 蛋白免疫印跡檢測HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7蛋白的表達 通過蛋白免疫印跡實驗，我們發現CRISPR/Cas9技術構建的Atg7基因敲除的HBMEC Atg7蛋白的表達完全消失。見圖3。

圖3 HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7蛋白的檢測

2.4 細胞免疫熒光檢測HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7蛋白的表達 利用免疫熒光染色觀察HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO中Atg7蛋白，結果表明HBMEC-atg7KO組與對照組HBMEC-Cas9相比Atg7的表達明顯減少。見圖4。

圖4 免疫熒光染色觀察Atg7的表達

2.5 光鏡下HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO的細胞形態 培養HBMEC-Cas9和HBMEC-atg7KO細胞，在光鏡下觀察它們的形態，Atg7敲除組與對照組相比，未見有明顯的細胞形態改變。見圖5。

圖5 細胞形態的觀察(×10)

3 討論

CRISPR/Cas9系統在1987年由Ishino等[14]發現以來，已經成為生物學家和遺傳學家最強大的工具之一。從2012年CRISPR/Cas9首次證明可以在體外進行DNA切割以來，該系統因為其比第一代ZFN和第二代TALEN基因編輯技術操作更為簡單、修飾更為精確、效率更為高效、成本更低等優點而廣泛應用[15]。該系統通過gRNA和Cas9蛋白可實現對靶基因DNA的識別和編輯；除了對單個堿基編輯外，我們可設計多個不同的gRNA介導Cas9蛋白同時進行多基因的編輯。

自噬中的關鍵基因Atg7作為研究的焦點，在發育、維系健康和控制疾病中發揮重要作用[16]。在前期研究中，在體實驗我們構建了內皮特異性敲除Atg7的小鼠；而體外實驗我們只能選擇RNAi技術瞬時敲減Atg7。由于RNAi技術只能短時間內使Atg7基因的表達下調，這極大的限制了我們對該基因功能的研究，而CRISPR/Cas9技術的應用使得這一問題迎刃而解。本研究中我們針對人Atg7基因第一個外顯子設計了2對sgRNA，構建重組質粒，與Cas9質粒共轉到HBMEC中，實現對HBMEC細胞進行Atg7基因的敲除。通過實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡實驗和細胞免疫熒光染色證明了我們在HBMEC細胞中成功敲除了Atg7基因。通過在光鏡下對Atg7敲除的HBMEC和對照組的細胞進行細胞形態觀察，我們未發現形態上有明顯改變。

綜上所述，我們利用CRISPR/Cas9技術成功構建了Atg7基因穩定敲除的HBMEC，這將極大促進我們對Atg7基因在腦血管的發育和血腦屏障形態建成的機制以及腦血管相關疾病的研究。