石菖蒲揮發(fā)油成分對正常SD乳鼠心肌細(xì)胞活力的影響*

程莉， 蒲秋易 ，左冠超

(1.成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 中藥劑科， 四川 成都 610095； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬四川省康復(fù)醫(yī)院 & 四川省八一康復(fù)中心 中西醫(yī)結(jié)合科， 四川 成都 610000)

石菖蒲屬天南星科植物，其根狀莖有氣味，葉全緣，兩排排列，肉質(zhì)圓錐花序，花梗綠色，刀叉狀。石菖蒲生長在海拔較高的地區(qū)，大多在山澗溪流水石縫隙或溝谷水與碎石之間，石菖蒲根莖常被用作藥材，具有化濕開胃、開竅豁痰、醒神益智的功效[1]。石菖蒲主要有效成分為揮發(fā)油，包括β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚及甲基異丁香酚等成分，其中β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚具有保護(hù)神經(jīng)、鎮(zhèn)靜及催眠的作用，臨床常用于治療老年癡呆、癲癇及抑郁癥[2]。中藥揮發(fā)油提取方法有蒸氣蒸餾、溶劑萃取、壓榨、微波萃取、超聲波提取及超臨界流體萃取法等，水蒸氣蒸餾法由于設(shè)備簡單、操作簡單、成本低，是常用的揮發(fā)油提取方法[3]，但該法在提取過程中存在乳化、油水分離困難等問題，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油提取率低且質(zhì)量差，因此從化學(xué)成分的角度探索揮發(fā)油的乳化機理，可為開發(fā)揮發(fā)油破乳技術(shù)提供理論依據(jù)、亦可提高揮發(fā)油的品質(zhì)[4]。氣質(zhì)聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS)法是將氣相色譜和質(zhì)譜儀結(jié)合并借助計算機進(jìn)行分析，具有GC的高分辨率和MS的高靈敏度，能夠同時獲取樣品成分種類和含量分布信息，并以圖像的形式反映分布情況[5-6]。本研究采用GC-MS法分析鑒定石菖蒲揮發(fā)油中各種成分的含量，并觀察其對正常大鼠心肌細(xì)胞活力的影響，對石菖蒲進(jìn)一步開發(fā)利用和質(zhì)量評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1主要儀器 使用美國安捷倫公司的Agilent 7890A/5975C型GC-MS，色譜柱為DB-5石英毛細(xì)管管柱，西安常儀儀器設(shè)備有限公司供應(yīng)的MH-1000型1 000 mL可調(diào)式電熱套，徐州江煤科技有限公司發(fā)布的供應(yīng)的TG328A型萬分之一電子天平。

1.1.2主要材料 石菖蒲飲片(安徽新興中藥材飲片有限公司)，經(jīng)鑒定為天南星科植物石菖蒲Acorus Tatarinowii Schott的干燥根莖；甲醇(美國Sigma Aldrich，)，無水Na2SO4(沈陽永恒運化工原料有限公司)，其他試劑為分析純。

1.2 研究方法

1.2.1揮發(fā)油制備 根據(jù)《中國藥典》中方法[7]，取石菖蒲藥材200 g粉碎過目篩，加水500 mL于1 000 mL電熱套中，提取4 h，取精油0.1 mL將揮發(fā)油反復(fù)溶出，并采用無水Na2SO4過夜后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過裝入樣品瓶中密封保存。

1.2.2溶液制備 (1)內(nèi)標(biāo)溶液：將十四醇、二十二烷溶解后裝于測量瓶中，然后調(diào)整規(guī)模獲得質(zhì)量濃度2 g/L十四醇溶液和22 g/L二十二烷溶液。(2)供試品溶液：取“1.2.1”項下?lián)]發(fā)油油1～12支，用無水乙醇溶解，裝入10 mL量瓶中，轉(zhuǎn)移1～100 mL的量瓶中，加入蒸餾水定容，然后轉(zhuǎn)移5～20 mL頂空取樣瓶中，并各加入50 μL的十四醇和二十二烷內(nèi)標(biāo)溶液，壓蓋密封，得到揮發(fā)油試驗溶液。

1.2.3色譜條件 石英毛細(xì)管管柱(0.25 mm×0.25 μm×60 mm)，柱流量1.0 mL/min，載氣為氦氣，汽化室溫度為250 ℃。升溫順序：溫柱90 ℃、保持1 min，以3 ℃/min速率升至120 ℃，然后以2 ℃/min速率升至140 ℃，保持3 min、以5 ℃/min速率升至190 ℃，最后以10 ℃/min速率升至260 ℃、保持2 min。分流比為50 ∶1，進(jìn)樣量為1.0 μL。

1.2.4質(zhì)譜條件 電離方式：電子轟擊(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度280 ℃，四級桿溫150 ℃，接口溫度280 ℃，掃描范圍20～550 m/z，掃描時間 200 ms。

1.2.5大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取出生24 h內(nèi)的SD乳鼠，麻醉處死，75%的酒精消毒后取出心臟，用預(yù)冷PBS緩沖液清洗3次，剪成塊狀放入小瓶子中并加入0.25%胰蛋白酶，4 ℃放置16 h取出后去除胰酶，然后加入0.25%胰酶，37 ℃放置20 min，并加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。使用100目鋼篩過濾細(xì)胞懸液后收集于離心管中，離心去上清后沉淀細(xì)胞加入含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶中，置37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，按差速貼壁分離法純化細(xì)胞，然后接種于培養(yǎng)板并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換1次培養(yǎng)液培養(yǎng)3～5 d。

1.2.6細(xì)胞活力檢測 采用MTT法測定細(xì)胞存活率：將心肌細(xì)胞懸液接種到96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞單層融合后用于后續(xù)實驗，實驗設(shè)正常培養(yǎng)組、基質(zhì)組及石菖蒲揮發(fā)油組。石菖蒲揮發(fā)油組：終濃度為60、80、100、120、140、160、180及200 mg/L的石菖蒲揮發(fā)油，與心肌細(xì)胞作用24 h備用；基質(zhì)組于細(xì)胞貼壁生長24 h時吸棄原培養(yǎng)基，PBS 沖洗3次加入人工缺氧液100 μL置于含94% N2、1% O2、5% CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min，吸棄缺氧液、加入DMEM高糖培養(yǎng)基、于正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min備用；正常培養(yǎng)組吸棄原培養(yǎng)基加入DMEM高糖培養(yǎng)基，置于正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min備用。MTT法為在96孔板中每孔加入MTT(5 g/L)10 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱4 h，吸去上清液后加入DMSO溶液裂解150 μL，避光下低速振蕩10 min使化合物溶解。用酶標(biāo)儀測定光密度(OD)值，測定波長為570 nm，每組設(shè)置6個重復(fù)樣品孔，重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 石菖蒲揮發(fā)油中醚類、酚類及烯類化學(xué)成分和相對類含量

石菖蒲揮發(fā)油主要含有醚類、酚類、烯類、醇類、萜類、素類、醛類及胺類化學(xué)成分。醚類和酚類所占比例最高，主要包括甲基乙丁香酚、甲基異丁香酚、異丁香粉甲醚、α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚等成分，占揮發(fā)油總量的95.78%；β-細(xì)辛醚含量最高、占揮發(fā)油的54.75%；其次為α-細(xì)辛醚、異丁香粉甲醚、甲基異丁香酚及甲基乙丁香酚，分別占揮發(fā)油的32.18%、2.27%、1.73%及1.60%。見表1。

表1 石菖蒲揮發(fā)油中醚類、酚類、烯類醇類、萜類、素類、醛類及胺類等化學(xué)成分含量Tab.1 Chemical constituents and relative contents of ethers, phenolsalkenes alcohols, terpenoids, aldehydes ,and amines in volatile oil of acorus gramineus

2.2 石菖蒲揮發(fā)油對正常心肌細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

基質(zhì)組與正常培養(yǎng)組心肌細(xì)胞存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與基質(zhì)組比較， 60～180 mg/L的石菖蒲揮發(fā)油組心肌細(xì)胞存活率升高，而200 mg/L石菖蒲揮發(fā)油組心肌細(xì)胞存活率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 石菖蒲揮發(fā)油對心肌細(xì)胞活力的影響Tab.2 Effect of volatile oil of acorus gramineus on activity of cardiomyocytes

3 討論

石菖蒲生于山谷、山澗和泉流的水石中，呈扁平圓柱形，表面褐色、棕紅色或灰黃色，粗糙，多節(jié)。辛、苦，性溫，歸心、肝及脾，胃經(jīng)，具有健胃祛風(fēng)、活血止痛、醒神益智、消腫及解毒等功效[8-11]。藥理研究表明，石菖蒲具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用，在一定濃度下可增加冠狀動脈流量，擴張冠狀血管，具有鎮(zhèn)靜、改善消化功能、平喘、止咳等作用；且對人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，能夠鎮(zhèn)靜、安神、催眠；又有著芳香化濁、祛痰濕的作用[12-13]。內(nèi)飲能促進(jìn)消化液分泌，抑制胃腸異常發(fā)酵，緩解腸平滑肌痙攣；此外還能抵抗組胺引起的支氣管收縮，用于臨床治療癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，療效良好，且可用于濕阻中焦、胸悶腹脹、胃口不佳、舌苔黃膩等癥狀，常與砂仁、厚樸、蒼術(shù)等化濕、行氣止痛的藥物同用，起到濕濁中阻、濕熱瀉痢的作用[14-15]。臨床常用于消化不良、胸腹脹滿、癲狂、癰癤腫痛等。近年來研究顯示，揮發(fā)油是石菖蒲鎮(zhèn)靜、睡眠及抗驚厥主要有效部位[16]。石菖蒲中揮發(fā)油氣味清香，能有效促進(jìn)消化液的分泌，抑制胃腸的異常發(fā)酵，能醒脾、醒胃消化，且對一些神經(jīng)系統(tǒng)動物模型具有重要的生理活性[17-18]。故本研究測定石菖蒲揮發(fā)油中成分及含量，為合理用藥提供依據(jù)。從中藥揮發(fā)油的提取方法包括蒸汽蒸餾、溶劑萃取法、按法、微波萃取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法等，因蒸汽蒸餾設(shè)備簡單、操作簡單和低成本，常用于是揮發(fā)油提取，但在提取過程中，油和水的乳化和分離困難是常見的問題，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油的提取率低，質(zhì)量差[19-20]。因此，從化學(xué)成分的角度探討揮發(fā)油的乳化機理，為開發(fā)揮發(fā)油破乳技術(shù)提供理論依據(jù)，在工業(yè)生產(chǎn)中，對高揮發(fā)油的收率和質(zhì)量具有十分重要的意義。常用測定方法為GC-MS，GC-MS是將氣相色譜和質(zhì)譜儀結(jié)合并借助計算機進(jìn)行分析，因其具有GC的高分辨率和MS的高靈敏度，能夠同時獲取樣品成分種類和含量分布信息，并以圖像的形式反映分布情況[5-6]。

有報道顯示，不同地區(qū)石菖蒲揮發(fā)油中成分含量不同，會結(jié)果產(chǎn)生一定影響[21-22]。而本研究中采用粉末配置，使結(jié)果更準(zhǔn)確，結(jié)果顯示，在石菖蒲揮發(fā)性成分研究中，共檢出35個化合物，包括醚類、酚類、烯類、醇類、萜類、素類、醛類及胺類化學(xué)成分，其中對醚類和酚類所占比例最高，主要包括甲基乙丁香酚、甲基異丁香酚、異丁香粉甲醚、α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚等成分，占揮發(fā)油總量的占揮發(fā)油總量的95.78%，石菖蒲揮發(fā)油主要含有甲基乙丁香酚、甲基異丁香酚、異丁香粉甲醚、α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚等成分，其中β-細(xì)辛醚含量最高，占揮發(fā)油的54.75%，其次為α-細(xì)辛醚、異丁香粉甲醚、甲基異丁香酚及甲基乙丁香酚，分別占揮發(fā)油的32.18%、2.27%、1.73%及1.60%。與吳啟端[23]、張莉等[24]報道一致，說明β-細(xì)辛醚為石菖蒲主要活性成分，其水煎劑可緩解胃腸平滑肌痙攣，促進(jìn)消化液分泌，停止胃腸異常發(fā)酵[25]。同時寧百樂等[26]研究顯示，石菖蒲揮發(fā)油具有興奮、抗抑郁、抗缺氧、鎮(zhèn)靜、催眠及抗驚厥作用。因此本研究認(rèn)為臨床可考慮采用石菖蒲揮發(fā)油代替石菖蒲材料。同時本研究還分析了這些揮發(fā)油成分對心肌細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，基質(zhì)組與正常培養(yǎng)組細(xì)胞存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明本實驗所用基質(zhì)濃度對正常心肌細(xì)胞活力無影響，而與基質(zhì)組比較，濃度為60～180 mg/L的石菖蒲揮發(fā)油組細(xì)胞存活率升高，濃度為200 mg/L的石菖蒲揮發(fā)油組細(xì)胞存活率降低，表明該濃度范圍為60～180 mg/L的石菖蒲揮發(fā)油可提高正常心肌細(xì)胞活力。

綜上所述，β-細(xì)辛醚為石菖蒲揮發(fā)油主要活性成分之一，可提高正常心肌細(xì)胞活力，因此建議考慮采用石菖蒲揮發(fā)油代替石菖蒲材料，但對于不同區(qū)域和品種間存在差異有待于進(jìn)一步研究，以期為臨床提供充足論證。