16S rRNA測序揭示豬日增重與腸道微生物的關(guān)系

呂冬玲，司景磊，莫家遠，李月月，田威龍，劉笑笑，梁晶,蘭干球

(廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

杜洛克豬原產(chǎn)于美國，因其瘦肉率高、生長速度快和飼料轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)勢，通常作為父本用來進行品種間的雜交和選育。平均日增重(ADG)是豬在某段時間內(nèi)平均每日增加的重量，是衡量豬生長性狀的一個重要指標。日增重高的豬能在更短的時間內(nèi)達到目標市場體重，節(jié)省出欄時間，因此提高豬的日增重是豬場的育種目標之一。近年來，腸道微生物的研究不斷發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物在營養(yǎng)加工和能量的獲取中起著至關(guān)重要的作用[1-2]。在單胃動物腸道中主要有3種微生物，分別是細菌、古菌和真核微生物，其中細菌是腸道中的優(yōu)勢微生物，尤其是厭氧細菌[3-4]。研究認為在豬生長的關(guān)鍵階段，腸道微生物與其健康和生產(chǎn)性能具有很大關(guān)系[5-9]。HAN等[10]研究發(fā)現(xiàn)飼料效率較高的豬盲腸乳酸菌數(shù)量較飼料效率低的更多；Mach等[11]研究表明普氏菌與體重呈正相關(guān)，不同體重的豬，其腸道微生物在一定程度上有差異，例如，在門的水平上，厚壁菌和浮霉菌在體重較大的豬中富集，而擬桿菌富集在體重較小的豬中[12]。

目前對于杜洛克的腸道微生物與其日增重關(guān)系的研究報道較少，本試驗利用高通量測序技術(shù)通過分析不同日增重杜洛克豬糞便微生物的多樣性，從而分析其腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)差異及其與日增重的關(guān)系，以期為利用微生物菌群提高豬日增重、縮短出欄時間從而提高養(yǎng)殖效率提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和飼養(yǎng)管理

91頭杜洛克公豬來自廣西南寧某核心育種場，28日齡斷奶，于相同的保育條件飼養(yǎng)至70日齡，平均體重(27.61±4.65)kg，隨即進入安裝有美國奧斯本自動喂料系統(tǒng)的測定站中進行性能測定，每個測定站面積為20 m2，飼喂10～12頭，公母分欄飼喂，正式測定前將有10 d左右的適應(yīng)期，在體重約100 kg時結(jié)束測定。育肥舍為全封閉的欄舍結(jié)構(gòu)，配有濕簾風(fēng)機自動控溫系統(tǒng)、全自動溫控通風(fēng)設(shè)備及半漏縫水泥地板設(shè)計。試驗期間飼喂相同的標準日糧，日糧成分及配方見表1，期間不添加抗生素、益生菌或藥物等，自由飲水。

表1 日糧成分及配方

1.2 樣品的收集與分組

調(diào)取奧斯本飼喂系統(tǒng)所記錄杜洛克公豬測定期間的每日采食量及體重數(shù)據(jù)，利用FIRE軟件統(tǒng)計豬在90～160日齡的平均日增重。根據(jù)91頭豬的平均日增重大小，取10頭日增重最高的豬作為HADG組，日增重區(qū)間1.10～1.18 kg，平均日增重(1.13±0.03) kg；10頭日增重最低的作為LADG組，日增重區(qū)間 0.72～0.89 kg，平均日增重(0.80±0.07)kg。肛拭子法采集糞便，放入滅菌試管，并迅速放于液氮速凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃保存，用于后續(xù)分析。

1.3 糞便微生物的提取及16S rRNA測序

參考Fast DNA SPIN soil kit(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,USA)說明書提取2組共20頭豬的糞便DNA，紫外分光光度計測定其濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。用細菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)的引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAG CA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對以上提取的DNA模板進行擴增，選用20 μL PCR體系，PCR反應(yīng)體系參考胡宗福等[13]方法，擴增產(chǎn)物純化后由Illumina Miseq平臺進行高通量測序并用以下軟件進行微生物分析(見表2)。

表2 微生物分析方法

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，顯著性分析采用t檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 豬糞便中微生物alpha多樣性

以Sobs, Shannon, Simpson, Ace, Chao, Coverage和Pd指數(shù)作alpha多樣性的參數(shù)(表3)，Coverage指數(shù)反映測序?qū)ξ锓N的覆蓋度，2組糞便微生物的Coverage均大于0.99(HADG組0.995 4，LADG組0.995 1)，證明數(shù)據(jù)是可靠的。Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可衡量物種的豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)可衡量物種的多樣性。發(fā)現(xiàn)HADG組和LADG組中alpha多樣性差異不顯著(P>0.05)。

表3 HADG和LADG組糞便微生物alpha多樣性的差異

2.2 豬糞便微生物類群的差異

在97%相似性的水平上，在門水平共檢測到14個菌群(圖1A)，其中有12個門是LADG與HADG組共有，厚壁菌門(Firmicutes, LADG組69.37%，HADG組66.90%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，LADG組27.10%，HADG組30.64%)是2組的優(yōu)勢菌門，螺旋菌門(Spirochaetes)為LADG組獨有(圖1C)。在屬水平，共檢測到114個菌群，其中107個是LADG與HADG組共有，4個LADG組獨有，3個HADG組獨有(圖1B)，屬水平上2組的優(yōu)勢菌群分別是普氏菌屬(Prevotella,LADG組16.90%，HADG組25.28%)和乳酸菌屬(Lactobacillus,LADG組12.81%，HADG組16.94%)(圖1D)。

利用主坐標分析分別比較了HADG和LADG組微生物菌群在門水平和屬水平上的相對豐度及其差異(圖2)，在門水平上，發(fā)現(xiàn)LADG組的螺旋體門(Spirochaetes), 軟壁菌門(Tenericutes), WPS-2以及疣微菌門(Verrucomicrobia)4個菌群的豐度要顯著高于HADG組(P<0.05)(圖2B)；在屬水平上發(fā)現(xiàn)HADG組中的巨球型菌(Megasphaere)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)和韋榮氏菌(unclassified_f_Veilionellacece)3個菌群的豐度顯著高于LADG組；瘤胃菌(norank_f_Ruminococcaceae)和擬桿菌(unclassified_o_Bacteroidales,norank_o_Bacteroidales)等在LADG組中富集度顯著高于HADG組(圖3B)。

A.門水平Venn圖；B.屬水平Venn圖；C.門水平的群落結(jié)構(gòu)；D.屬水平的群落結(jié)構(gòu)

A.門水平的PCoA圖；B.門水平的差異菌群。其中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，下同

2.3 糞便微生物的功能預(yù)測和KEGG通路比較

PICRUSt對OTUs的豐度進行標準化并獲得相應(yīng)的KEGG信息及相應(yīng)的豐度值，然后用STAMP軟件(version 2.1.3)進行代謝通路差異分析，以Welch’s雙尾檢驗預(yù)測功能通路的差異性，顯著性閾值為P<0.05。結(jié)果表明高低組間的4條通路有顯著性差異(P<0.05)，其中LADG組中細胞運動和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的豐度顯著高于HADG組(P<0.05)；Poorly characterized通路極顯著地富集在HADG組中(P<0.01)，代謝疾病通路的豐度顯著高于LADG組(P<0.05)(圖4A)。KEGG的三級代謝通路預(yù)測發(fā)現(xiàn)了LADG和HADG 2組有24條顯著差異的三級通路，其中HADG組中的無機離子的轉(zhuǎn)運和代謝、Ⅱ型糖尿病通路的豐度極顯著高于LADG組，脂類生物合成蛋白通路豐度LADG組極顯著地高于HADG組(圖4B)。

3 討論

下一代測序技術(shù)拓寬了遺傳育種的研究領(lǐng)域[9]。Mach等[11]提出早期腸道微生物的豐度對宿主的性狀至關(guān)重要，同時也有助于種豬的早期選擇。從公式：選擇進展=選擇差×選擇強度/世代間隔[14]，可以看出選擇強度和選擇差的提高及世代間隔的減小均可增加選擇進展，尤其是對遺傳力較低的一些性狀。

本研究將杜洛克公豬分為LADG和HADG 2組，并對2組豬的糞便微生物群落進行對比分析和功能預(yù)測。以Sobs, Shannon, Simpson, Ace, Chao, Coverage和Pd指數(shù)作alpha差異分析的參數(shù)，Coverage指數(shù)反映測序?qū)ξ锓N的覆蓋度，2組糞便微生物的Coverage均大于0.99，證實了數(shù)據(jù)的可靠性。Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可衡量物種的豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)可衡量物種的多樣性[15]。alpha差異分析顯示2組微生物的豐富度都很高，HADG組Chao指數(shù)和Ace指數(shù)2個指數(shù)比LADG組高但并不顯著，說明一定程度上HADG組物種有更高蛋白豐富度；HADG組的Shannon指數(shù)比LADG組高，Simpson指數(shù)比LADG組低，但差異不顯著，說明一定程度上HADG組的微生物群落多樣性更豐富。

前人研究發(fā)現(xiàn)不同豬不同生長階段的腸道微生物組成有差異，這可能與其生長狀態(tài)等有關(guān)系，仔豬在出生后0～2 d和7 d～斷奶前的腸道微生物組成從以好氧和兼性厭氧菌為主(主要為葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌屬)過渡到嚴格厭氧菌為優(yōu)勢菌群(主要為厚壁菌群和擬桿菌群)[16]；Wang等[17]研究了仔豬從出生(0日齡)到上市(174日齡)的糞便微生物結(jié)構(gòu)群落，表明厚壁菌門和擬桿菌門是豬從出生到上市的優(yōu)勢菌門；Mach等[11]研究表明普氏菌與體重呈正相關(guān)；Pajarillo等[18]發(fā)現(xiàn)在門水平杜洛克、長白和大白3個豬種的微生物結(jié)構(gòu)是相似的，主要以厚壁菌門和擬桿菌門為主。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門是門水平的2個優(yōu)勢菌群，這與Si等[19]的研究結(jié)果一致；螺旋體門、軟壁菌門，WPS-2以及疣微菌門這4個菌群在LADG 組的豐度要顯著高于 HADG 組，表明這4個菌群的群落結(jié)構(gòu)可能對豬的日增重有負相關(guān)作用；在屬水平上2組的優(yōu)勢菌群均是普氏菌(Prevotella)和乳酸菌(Lactobacillus)，這一結(jié)果與楊慧[20]的結(jié)果相一致；HADG組中的巨球型菌(Megasphaere)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)和韋榮氏菌(unclassified_f_Veilionellacece)這3個菌群的富集顯著高于LADG組，推測這4個菌群可能與日增重有正相關(guān)作用，可促進杜洛克豬的生長和發(fā)育；還發(fā)現(xiàn)一些菌群在LADG組中富集度顯著高于HADG組，例如瘤胃菌(norank_f_Ruminococcaceae)和擬桿菌(unclassified_o_Bacteroidales,norank_o_Bacteroidales)等，初步推測瘤胃菌和擬桿菌群的富集對豬的日增重有負相關(guān)作用。

A.屬水平的PCoA圖；B.屬水平的差異菌群

A.二級代謝通路；B.三級代謝通路

豬不同日增重的差異可能還與微生物的代謝途經(jīng)有關(guān)，KEGG的二級通路分析發(fā)現(xiàn)HADG組的疾病代謝和Poorly characterized通路的富集要顯著高于LADG組，表明HADG組相較LADG組有更強的疾病代謝能力；KEGG的三級通路分析發(fā)現(xiàn)HADG組的無機離子的轉(zhuǎn)運和代謝、谷胱甘肽的代謝、氨基糖和核苷酸糖的代謝、核黃素代謝、嘌呤代謝和亞硒化合物的代謝通路的富集度顯著高于LADG組，提示HADG組的營養(yǎng)物質(zhì)的代謝水平更高。核黃素即VB2，是機體生長發(fā)育必不可少的一種維生素，可以促進機體碳水化合物、核酸等物質(zhì)的代謝，增加機體的抗氧化能力的同時降低心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險等[21]；嘌呤是核酸的重要組成成分，對機體的新陳代謝也有重要意義，大多數(shù)動植物細胞尤其在動物內(nèi)臟器官中都含有大量的嘌呤，嘌呤的大量堆積可能會導(dǎo)致尿酸的沉積，進而引發(fā)痛風(fēng)等嘌呤代謝障礙性疾病[22-23]。三級通路中脂肪酸的生物合成、分泌系統(tǒng)通路富集LADG組顯著高于HADG組，病原體入侵宿主細胞會對宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響[24]，細菌可以利用宿主的分泌系統(tǒng)來破壞宿主的一些功能，Rapisarda等[25]通過對比革蘭陽性和革蘭陰性細菌各自分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)與其自身的毒性有關(guān)。推測糞便微生物與宿主的相互作用可能與其分泌系統(tǒng)的功能也有一定相關(guān)。

4 結(jié)論

厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)是LADG和HADG組的優(yōu)勢菌門，普氏菌屬(Prevotella)和乳酸菌屬(Lactobacillus)是這2組的優(yōu)勢菌屬。2組微生物在代謝通路上有差異：微生物在疾病代謝尤其是嘌呤代謝和核黃素代謝等通路高度富集在HADG組中；而微生物的分泌系統(tǒng)等通路高度富集在LADG組中。提示HADG組的代謝水平更高，LADG組的分泌系統(tǒng)較HADG組更發(fā)達。這一結(jié)果為理解早期宿主與豬腸道微生物相互作用提供了幫助，對仔豬的早期選育提供了新的思路。