響應面法優化固定超聲輔助提取玫瑰花黃酮的工藝

丁 強，董紀超，莢啟安，吳澤宇，張文成

（1.合肥工業大學食品與生物工程學院，農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥230009；2.廬江縣璟泰玫瑰花種植有限責任公司，安徽合肥230000）

玫瑰

（Rosa rugosa

Thunb

.

）是薔薇科薔薇屬灌木植物。玫瑰有觀賞、藥用、食用之分，其中食用玫瑰有甘肅的苦水玫瑰、山東的平陰玫瑰、保加利亞大馬士革玫瑰等。食用玫瑰產品種類豐富，有玫瑰花茶、玫瑰飲料、玫瑰鮮花餅、玫瑰花醬、玫瑰酵素、玫瑰精油、玫瑰純露等。玫瑰花含有的主要功能性成分有黃酮類化合物、多糖類化合物、多酚類化合物、揮發性香氣成分等，其具有抗氧化、抑菌、免疫調節、降血糖血脂、減緩焦慮等功效。Abhisek Karn研究了柑橘黃酮類化合物對腸道菌群具有明顯的調節能力，證實黃酮體內促健作用，為黃酮在功能性食品中的應用提供科學指導。黃酮類化合物的提取方法主要有溶劑提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶解輔助提取和共溶劑提取法等。而超聲輔助提取具有方便省時、成本低、效率高等優點，為此本試驗采用固定法超聲輔助乙醇提取玫瑰花黃酮，采用響應面法優化了提取工藝參數。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

玫瑰干花蕾，廬江縣璟泰玫瑰花種植有限責任公司；蘆丁對照品，純度98.44%，北京北方偉業計量技術研究院；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

KQ-500B型超聲波器，昆山市超聲儀器有限公司；TG61-WS湘立離心機，湖南湘立科學儀器有限公司；UV-1800PC紫外可見分光光度計，翱藝儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玫瑰黃酮提取工藝流程

玫瑰干花蕾→粉碎→過200目篩→超聲輔助溶劑提取→粗濾→離心→抽濾→黃酮提取液→顯色處理→黃酮檢測

1.2.2 提取單因素試驗

（1）不同乙醇體積分數對提取黃酮的影響

稱取玫瑰粉（200目，下同）0.5 g，放入250 mL具塞三角錐形瓶中，分別加入乙醇體積分數為0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇水溶液10 mL，提取溫度60℃，提取時間40 min，提取液粗濾，4 000 r/min離心10 min，上清液抽濾，濾液放置室溫測定黃酮含量。

（2）不同料液比對提取黃酮的影響

稱取玫瑰粉0.5 g，放入250 mL具塞三角錐形瓶中，加入乙醇體積分數為40%的乙醇水溶液，料液比設計為0.5∶5，0.5∶10，0.5∶15，0.5∶20，0.5∶25（g/mL），提取溫度60℃，提取時間40 min，提取液粗濾，4 000 r/min離心10 min，上清液抽濾，濾液放置室溫測定黃酮含量。

（3）不同提取時間對提取黃酮的影響

稱取玫瑰粉0.5 g，放入250 mL具塞三角錐形瓶中，加入乙醇體積分數為60%的乙醇水溶液10 mL，提取溫度60℃，提取時間設計為20 min、40 min、60 min、80 min、100 min，提取液粗濾，4 000 r/min離心10 min，上清液抽濾，濾液于室溫下測定黃酮含量。

（4）不同溫度對提取黃酮的影響

稱取玫瑰粉0.5 g，放入250 mL具塞三角錐形瓶中，加入乙醇體積分數為60%的乙醇水溶液10 mL，提取溫度設計為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，提取時間40 min，提取液粗濾，4 000 r/min離心10 min，上清液抽濾，濾液放置室溫測定黃酮含量。

1.2.3 響應面法優化試驗

經單因素試驗，確定乙醇體積分數為60%。選擇料液比、提取時間、提取溫度三個因素，設計三因素三水平進行響應面優化試驗。試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Tab.1 Factor and levels of response surface experiment

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 黃酮提取液光譜掃描

用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法顯色處理黃酮提取液，紫外可見分光光度計進行200～700 nm的波長掃描，510 nm是黃酮絡合物的特征吸收峰。

1.2.4.2 標準曲線制作

稱取蘆丁20 mg，用體積分數為30%的乙醇溶液定容于100 mL容量瓶，得到蘆丁標準溶液，濃度0.2 mg/mL。分別吸取標準溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL于25 mL容量瓶中，加入體積分數為30%的乙醇溶液，使體積為12.5 mL，加入質量分數為5%的亞硝酸鈉溶液0.7 mL，搖勻放置5 min，加入質量分數為10%的硝酸鋁溶液0.7 mL，搖勻放置6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，用體積分數為30%的乙醇溶液定容至刻度。搖勻靜置10 min，于波長510 nm處測吸光度。

標準曲線回歸方程：Y=11.438X-0.001 3，R=0.986 2，X代表蘆丁濃度，mg/mL；Y代表吸光度值，濃度在0～0.056 mg/mL范圍內與吸光度呈良好線性關系，相關系數較高。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同乙醇體積分數對黃酮提取得率的影響

由圖1可知，用純水做提取劑提取得率不高。隨著乙醇體積分數增大，提取得率隨之增大，加入乙醇溶劑的極性增加使黃酮更好溶出；當乙醇體積分數超過60%后，提取得率下降。因此選乙醇體積分數為60%的提取劑。

圖1 不同乙醇體積分數對黃酮提取得率的影響Fig.1 Effects of different ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids

2.1.2 不同料液比對黃酮提取得率的影響

由圖2可知，料液比0.5∶5（g/mL）時提取得率很小，提取劑過少，黃酮溶出有限；隨著料液比增加，黃酮溶出增加，提取得率變大，繼續增大料液比，提取得率已趨于穩定不再增加。因此料液比選擇為0.5∶10（g/mL）。

圖2 不同料液比對黃酮提取得率的影響Fig.2 Effects of different solid-liquid ratio concentration on the extraction rate of flavonoids

2.1.3 不同提取溫度對黃酮提取得率的影響由圖3可知，隨著溫度增加提取得率增加，因為溫度升高加快分子擴散，促進溶劑分子與黃酮物質接觸，有利于黃酮溶出。繼續升高溫度，提取得率下降。因此提取溫度選擇為40℃。

圖3 不同提取溫度對黃酮提取得率的影響Fig.3 Effects of different extraction temperature concentration on the extraction rate of flavonoids

2.1.4 不同提取時間對黃酮提取得率的影響

由圖4可知，隨著提取時間增加，提取得率逐漸增大，60 min達到最大提取得率；再延長提取時間，提取得率下降。因此選擇最佳提取時間為60 min。

圖4 不同提取時間對黃酮提取得率的影響Fig.7 Effects of different extraction time concentration on the extraction rate of flavonoids

2.2 響應面法優化實驗結果

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析

在響應面試驗因素水平表1設計下進行響應面試驗，試驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果Tab.2 Results of response surface experiment

方差分析顯示，模型回歸值較高，F=88.45，P＜0.000 1，說明響應面模型具有極顯著性。失擬項表示模型與實驗擬合的程度，即二者的差異程度，失擬項（P=0.201 8＞0.05），失擬項不顯著，這對模型是有利的，無失擬因素存在，因此可用該模型對實驗結果進行分析。

編碼自變量的擬合多元二次回歸方程：提取得率=+3.03+0.87A+0.037B+0.037C+0.033AB+0.022AC+0.19BC-0.16A-0.018B-0.13C

實驗值的擬合多元二次回歸方程：提取得率=-0.854 36+0.618 89A-0.049 133B+6.450 00E-0.03C+1.083 33E-0.03AB-3.750 00E-0.04AC+9.375 00E-0.04BC-0.017 528A-1.775 00E-0.04B-3.193 75E-0.04C

2.2.2 最佳提取方案及模型驗證

響應面法優化試驗設計的最佳提取方案：料液比0.5∶13 g/mL，提取溫度50℃，提取時間75.92 min。預測黃酮提取得率是3.870 24%。根據實際情況，乙醇體積分數定為60%，將最佳提取方案改為：料液比0.5∶13 g/mL，提取溫度50℃，提取時間76 min，進行驗證試驗，結果：提取得率為3.77%，與模型預測提取得率接近。因而模型可用于黃酮提取得率預測。

2.2.3 最佳提取次數

由表3可知，經兩次提取，累計得率已接近95%；再提取得率無明顯提高，綜合實際考慮選擇2次提取即可。

表3 提取次數對黃酮提取得率的影響Fig.3 Effects of extraction times concentration on the extraction rate of flavonoids

3 結論

本文采用固定法超聲輔助乙醇提取玫瑰花黃酮，通過單因素實驗和響應面優化設計，采用Design-Export 8.0.6 Trial軟件的Box-Behnken設計實驗并進行回歸模型方差分析，結果顯示模型可靠。結合實際可操作性，模型預測的最佳提取工藝條件的優選參數：乙醇體積分數60%，料液比0.5∶13 g/mL，提取溫度50℃，提取時間76 min，該條件下的提取得率為3.77%；驗證試驗結果與模型預測提取得率接近，說明模型能很好地預測玫瑰花黃酮的提取得率。