手機(jī)成像在生物活性物質(zhì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

謝旭婷，Cheong Kit-Leong

（汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系，廣東 汕頭515063）

目前實(shí)驗(yàn)教學(xué)依然在高校所開設(shè)課程中占極大比重，其對提高學(xué)生的動(dòng)手實(shí)操能力以及實(shí)踐創(chuàng)新能力都有著舉足輕重的作用。在傳統(tǒng)的生物活性物質(zhì)實(shí)踐課教學(xué)過程中，受器材、專業(yè)實(shí)驗(yàn)員數(shù)量、學(xué)生人數(shù)等因素限制，往往多為驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)或模擬實(shí)操，不能保證每位學(xué)生的參與。為了培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐能力與創(chuàng)新能力，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，在保留原有的生物活性物質(zhì)實(shí)驗(yàn)課程的基礎(chǔ)上，對實(shí)際操作進(jìn)行了一定創(chuàng)新，以求在達(dá)到教學(xué)目的的同時(shí)激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)造性，提高其學(xué)習(xí)熱情。

近年來隨著對生物活性物質(zhì)的研究與開發(fā)利用的深入，對天然來源的低聚糖的研究也越來越受到關(guān)注。低聚糖是一種低分子量、低聚合度的糖類化合物，由2～20個(gè)單糖通過糖苷鍵連接而形成直鏈或支鏈，因其多樣的生物活性如抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等受到業(yè)界廣泛關(guān)注。而由于結(jié)構(gòu)與功能之間存在的緊密聯(lián)系，對低聚糖的結(jié)構(gòu)分析也成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。但目前對低聚糖混合物的分離和性質(zhì)研究仍是糖類研究中的難點(diǎn)之一，其主要原因是糖分子因缺乏生色基團(tuán)或熒光基團(tuán)，使其直接檢測困難，并且由于低聚糖的化學(xué)組成類似，存在多種異構(gòu)體，且具有不同的連接方式和分支形式，其結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜多樣，因此分離難度很大。常用的低聚糖結(jié)構(gòu)分析方法包括高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）、質(zhì)譜（MS）、核磁（NMR）以及薄層色譜（TLC）和熒光輔助糖電泳（FACF）等。其中HPLC具有重現(xiàn)性好、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，常用于糖類的定量分析，但其樣品前處理過程比較繁瑣；GC一般要求樣品具備一定的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性；NMR在確定低聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有高特異性、高靈敏度、結(jié)果信息豐富等優(yōu)點(diǎn)。但這些方法需要昂貴的儀器和專業(yè)技術(shù)人員，并且它們在應(yīng)用上具有一定的局限性；而采用TLC法雖然操作簡單，但分辨率低且不能將結(jié)構(gòu)相似的糖組分分開；相比而言，F(xiàn)ACE則是一種簡單、快速、靈敏的糖類分析方法，其可同時(shí)對多個(gè)中性和酸性低聚糖樣品進(jìn)行分析，因此較適用于低聚糖的分離。

FACE操作簡單且不需要昂貴儀器以及專業(yè)技術(shù)人員，學(xué)生均可參與實(shí)驗(yàn)，是一種比較適用于本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法。傳統(tǒng)FACE實(shí)驗(yàn)中使用凝膠成像分析系統(tǒng)對低聚糖電泳條帶進(jìn)行拍照，而因各實(shí)驗(yàn)室凝膠成像分析儀數(shù)量有限，學(xué)生往往需排隊(duì)輪流使用或分小組派代表進(jìn)行操作。為了達(dá)到使每位學(xué)生在既定課堂時(shí)間內(nèi)均參與實(shí)驗(yàn)的目的，我們在傳統(tǒng)的FACE實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用智能手機(jī)空間成像系統(tǒng)在紫外暗箱中對電泳所成低聚糖分離條帶進(jìn)行拍照，并與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中使用凝膠成像分析系統(tǒng)所獲取的圖片進(jìn)行分析對比，以期在提高教學(xué)質(zhì)量的同時(shí)獲得更快速簡便的低聚糖糖譜分析技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

昆布二糖、三糖、四糖、五糖標(biāo)準(zhǔn)品，Solarbio公司；瓊膠二、四、六、八、十、十二糖標(biāo)準(zhǔn)品，Solarbio公司。

氨基-1，3，6-萘三磺酸二鈉鹽（ANTS）；氰基硼氫化鈉（NaBHCN）；二甲亞砜（DMSO）；丙烯酰胺；雙丙烯酰胺；過硫酸銨（AP）；四甲基乙二胺（TEMED）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）；鹽酸（HCl）；乙酸；尿素；甘氨酸；氫氧化鈉，以上試劑均為分析純，用水為蒸餾水。

1.2 主要儀器

電泳儀；華為智能手機(jī)；蘋果智能手機(jī)；凝膠成像分析系統(tǒng)；天平；氮吹儀；冰箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）溶液配制

配制0.1 mol/L ANTS溶液，1 mol/L NaBHCN溶液，6 mol/L尿素，1.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl，1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl，10%AP，pH 8.8 Gly-Tris電泳緩沖液，含37%丙烯酰胺與3%雙丙烯酰胺的分離膠與濃縮膠母液，棕色瓶4℃保存。

（2）ANTS衍生化

取聚合度分別為2、3、4、5的昆布寡糖標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg分別溶解于1 mL 50%的乙醇水溶液中，配制昆布寡糖原始樣液，從各樣液中各取60μL混合得昆布寡糖標(biāo)準(zhǔn)品母液。將母液氮?dú)獯蹈苫騼龈桑尤?0μL 00.1 mol/L ANTS溶液和20 L 1mol/L NaCNBH溶液，混勻后置37℃水浴衍生化16 h。然后于35℃將糖樣品吹干，加300μL 6 mol/L尿素重懸得昆布寡糖樣品溶液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

同上，取聚合度分別為2、4、6、8、10、12的瓊膠寡糖標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg溶解衍生得瓊膠寡糖樣品溶液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）制膠

將玻璃板清洗干凈，待用。根據(jù)ZHANG等電泳方法稍作修改，按表1分別配制分離膠和濃縮膠，先配制好分離膠后立即緩緩注入制膠槽，緩慢加入1 mL水壓實(shí)，待分離膠完全凝固后把水吸出，注入濃縮膠，并在上方放置合適梳子以形成加樣孔。濃縮膠凝固后輕輕拔出梳子，將凝膠連同膠槽板一起放入裝有適量緩沖液的電泳槽內(nèi)待用。

表1 分離膠和濃縮膠的配制Tab.1 Preparation of separation glue and concentrated glue

（4）加樣

使用移液器分別吸取10μL稀釋64、32、24、16、8、4、2倍的昆布寡糖樣品溶液，緩慢加至浸沒電泳緩沖液的加樣孔內(nèi)。

使用移液器分別吸取10μL稀釋64、32、24、16、8、4、2倍的瓊膠寡糖樣品溶液，緩慢加至浸沒電泳緩沖液的加樣孔內(nèi)。

（5）電泳

將電泳槽放在冰水浴中，連接正負(fù)極，啟動(dòng)電源，設(shè)置電壓、電流、功率、時(shí)間分別為350 V、150 mA、30 W、2 h；電泳結(jié)束后在365 nm紫外燈下觀察。用凝膠成像儀、蘋果手機(jī)和華為手機(jī)分別拍照、保存、分析。流程如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Experimentalprocess

2 結(jié)果與分析

2.1 ANTS與糖衍生化機(jī)理

ANTS衍生反應(yīng)過程同其他胺化還原反應(yīng)相同，首先還原糖分子在溶液中存在著半縮醛和醛之間的動(dòng)態(tài)平衡。然后標(biāo)記物ANTS的氨基與糖的還原端（醛基）發(fā)生親核反應(yīng)，消除一分子水，產(chǎn)生席夫堿（Schiff′s base），形成醛與席夫堿之間的動(dòng)態(tài)平衡，最后氰基硼氫化鈉將生成的席夫堿迅速專一地還原成穩(wěn)定的二級胺。見圖2。

圖2 ANTS與糖衍生化反應(yīng)機(jī)理示意圖Fig.2 Schematic diagram of derivative reaction mechanism between ANTS and sugar

2.2 寡糖電泳結(jié)果

通過衍生化反應(yīng)，寡糖分子的還原末端結(jié)合熒光集團(tuán)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳進(jìn)行分離，最終得到的結(jié)果經(jīng)過紫外燈照射后，可以根據(jù)電泳條帶的數(shù)量及熒光強(qiáng)度判斷出寡糖的成分及其含量，根據(jù)電泳結(jié)果得到不同數(shù)量條帶，代表不同聚合度的寡糖。寡糖與ANTS進(jìn)行衍生反應(yīng)，在紫外透射光條件下顯示熒光條帶，每個(gè)條帶代表一種寡糖。圖3、圖4為不同成像設(shè)備拍照所得的昆布寡糖和瓊膠寡糖凝膠分離譜圖及利用Quantity one與Origin軟件轉(zhuǎn)換的對應(yīng)峰圖。

圖3 昆布寡糖標(biāo)準(zhǔn)品電泳條帶與對應(yīng)峰圖Fig.3 The electrophoretic bands and corresponding peaks of laminaria oligosaccharide standards

圖4 瓊膠寡糖標(biāo)準(zhǔn)品電泳條帶與對應(yīng)峰圖Fig.4 The electrophoretic bands and corresponding peaks of agar oligosaccharide standards

由圖3可知，不同聚合度的昆布寡糖的分離效果明顯。這是由于聚合度小的糖比聚合度大的糖遷移得快導(dǎo)致的結(jié)果。由電泳條帶可以看出，有4種組分得到了有效的分離，根據(jù)條帶位置可判斷由上至下分別代表聚合度為5、4、3、2的昆布寡糖。通過對比三種成像方式得出的照片可明顯得出，利用智能手機(jī)成像系統(tǒng)拍照得出的電泳條帶圖分辨率更高，凝膠成像儀顯現(xiàn)5條泳道的條帶圖，而智能手機(jī)可顯現(xiàn)6條泳道的條帶圖。與之對應(yīng)的峰圖也進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)果，且由峰圖可知，智能手機(jī)成像系統(tǒng)所得照片各條帶的豐度明顯高于凝膠成像儀所成照片中各條帶豐度。

由圖4可知，不同聚合度的瓊膠寡糖分離效果明顯。由電泳條帶可以看出，有6種組分得到了有效的分離，根據(jù)條帶位置可判斷由上至下分別代表聚合度為12、10、8、6、4、2的瓊膠寡糖。同上，對比三種成像方式得出的照片可明顯得出，利用智能手機(jī)成像系統(tǒng)拍照得出的電泳條帶圖分辨率更高，凝膠成像儀清晰顯現(xiàn)5條泳道的條帶圖，而智能手機(jī)可清晰顯現(xiàn)7條泳道的條帶圖。與之對應(yīng)的峰圖也進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)果，并且由峰圖可知，智能手機(jī)成像系統(tǒng)所得照片各條帶的豐度明顯高于凝膠成像儀所成照片中各條帶豐度。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中，在寡糖分子中引入熒光基團(tuán)ANTS后，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳能有效地分離鑒定不同聚合度的寡糖混合物。根據(jù)不同聚合度的寡糖分子在電場中的遷移速度不同可迅速分離不同聚合度的寡糖，并由條帶位置判斷各聚合度寡糖。結(jié)合電泳條帶與其對應(yīng)的峰圖可得出，使用智能手機(jī)成像系統(tǒng)拍攝的照片比凝膠成像儀所成的照片具有更高的分辨率，且各條帶對應(yīng)峰的豐度明顯高于凝膠成像系統(tǒng)拍攝的照片。再者，使用智能手機(jī)成像系統(tǒng)拍攝電泳結(jié)果圖的方法，操作簡單，設(shè)備充裕，不需要特別昂貴的儀器和操作熟練的技術(shù)人員，在一般實(shí)驗(yàn)室中就可以完成這項(xiàng)工作，因此可作為一種新型實(shí)驗(yàn)方式應(yīng)用于教學(xué)實(shí)驗(yàn)中。

本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)基于凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳條帶照片的內(nèi)容下，采取了一種新型的實(shí)驗(yàn)方式，利用智能手機(jī)成像系統(tǒng)對電泳結(jié)果進(jìn)行拍照，使用Quantity One與Origin軟件進(jìn)行峰圖轉(zhuǎn)換，得出利用智能手機(jī)成像系統(tǒng)可完成電泳結(jié)果的拍攝要求，且明顯優(yōu)于凝膠成像系統(tǒng)所得照片。這一方法可應(yīng)用于高校生物活性物質(zhì)實(shí)驗(yàn)課程中的電泳實(shí)驗(yàn)課程，尤其是對糖類物質(zhì)的分離鑒定，加之目前學(xué)生基本人手一部智能手機(jī)，因此實(shí)驗(yàn)取材方便，且相較于凝膠成像儀，智能手機(jī)更經(jīng)濟(jì)適用且不需專人指導(dǎo)，彌補(bǔ)了高校生物活性物質(zhì)實(shí)驗(yàn)課程中因?qū)嶒?yàn)設(shè)備凝膠成像儀數(shù)量不足造成的學(xué)生無法全部實(shí)操的缺憾。

實(shí)驗(yàn)中采用的新型實(shí)驗(yàn)方式開發(fā)了學(xué)生的創(chuàng)造性，提高了學(xué)生參與課程的積極性，增強(qiáng)了學(xué)生對生物活性物質(zhì)實(shí)驗(yàn)課的興趣。實(shí)驗(yàn)中每位學(xué)生都參與并對自己所拍攝的照片進(jìn)行峰圖轉(zhuǎn)換與分析，不僅提升了必要的實(shí)驗(yàn)技能，也掌握了結(jié)果處理與分析的能力，培養(yǎng)了學(xué)生獨(dú)立分析和解決問題的能力。同時(shí)該方法還能更好地活躍課堂氛圍，有助于學(xué)生對知識的記憶，并且對教師提高課堂效果，完成教學(xué)目標(biāo)具有一定助益。