基于16S rRNA V4區高通量測序的初治菌陽肺結核患者腸道菌群構成與表型分析

易一行 喻容 石國民 馬小華 肖四方 稅劍 范任華 向延根

結核病是由結核分枝桿菌復合群感染引起的慢性傳染性疾病，人類以結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染最常見。MTB感染機體后，因其專性需氧的特性，通常以肺部感染最常見，即引起“肺結核”。 MTB是單一病原體感染致死的主要原因之一，對人類健康與公共衛生安全造成了極大的威脅[1]，因此，采取有效的預防措施，減少宿主對MTB的易感性，對結核病的預防和控制具有重要意義。

“肺-腸軸”理論的提出，揭示了腸道菌群與肺部疾病的發展有關[2]，動物實驗揭示了腸道菌群與肺結核之間的相關性，Winglee等[3]發現MTB感染會使小鼠腸道菌群種類與豐富度顯著降低。宿主腸道菌群失調后，肺樹突狀細胞C型凝集素受體的表達下調，降低了CD4+T細胞的活化水平，進而增強了宿主對MTB的易感性[4]。獼猴的基線腸道菌群狀況與MTB感染后的病情嚴重程度相關[5]，給腸道菌群失調的小鼠進行糞便移植或者補充植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantarum)能夠恢復小鼠的抗MTB免疫力[4]，這表明宿主腸道菌群失調可能會影響人類MTB感染后的疾病進展，以及導致宿主對MTB的易感性，但目前與之相關的臨床研究少有報道。

高通量測序技術加速了人類對腸道微生態的理解，分析宿主在健康和患病狀態時腸道菌群的組成，可以識別與疾病有關的腸道菌群改變，為疾病的預防和治療提供新的干預措施。筆者基于臨床研究收集29例肺結核患者與28名健康對照者的糞便進行高通量測序與生物信息學分析，對兩組樣本腸道菌群多樣性、結構、細菌表型之間的差異進行分析，以期為結核病的治療與預防提供新的方向。

材料和方法

一、 材料收集

1.研究對象：采集2020年4月14日至12月28日就診于南華大學附屬長沙中心醫院29名確診為初治菌陽肺結核患者(肺結核組)的糞便標本。采集同期在本院進行健康體檢的28名志愿者(對照組)糞便標本。志愿者年齡、性別、居住地與納入患者匹配。兩組研究對象的一般資料見表1。

表1 一般資料在肺結核組和對照組中的分布情況

2.肺結核組納入標準：(1)年齡18～60歲；(2)肺結核診斷標準為《WS 288—2017肺結核診斷》[6]，經利福平耐藥基因檢測、分枝桿菌快速培養、MTB核酸檢測鑒定為MTB病原學陽性，結合胸部CT檢查確定為肺結核患者；(3)既往無抗結核治療史；(4)3個月內未服用抗生素與益生菌產品；(6)同意入組，簽署知情同意書。對照組入組標準：(1)年齡18～60歲；(2)體檢結果提示身體健康且無胃腸道疾病史；(3)3個月內未服用抗生素與益生菌產品；(4)同意入組，簽署知情同意書。排除標準：(1)孕婦或備孕者；(2)精神障礙患者；(3)嚴重心、肝、腎等疾病患者；(4)使用免疫抑制劑患者；(5)3個月內參加其他藥物臨床實驗患者。倫理學審核：該項目通過南華大學附屬長沙市中心醫院倫理委員會批準，倫理審批號：R201956。

二、 研究方法

1. 糞便標本采集：使用無菌棉簽，于清晨采集對照組與肺結核組新鮮糞便1～2 g置于細菌DNA保存液中，并立即轉入-70 ℃冰箱保存待檢。

2．糞便標本DNA提取與PCR擴增：使用PowerMax DNA(MoBio實驗室，浙江杭州設備制備，批號：20190952)分離試劑盒從糞便樣本中提取細菌全基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳確定所提取的細菌總DNA完整性后，使用NanoDrop?ND-1000分光光度計(美國賽默飛世爾科技有限公司)對所提取DNA進行定量，將細菌總DNA主帶完整無污染的樣本進行進一步檢測。使用PCR擴增引物 (正向引物515F: 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，反向引物806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 對細菌總DNA中16S rRNA gene V4區進行擴增建庫。采用Agencourt AMPure XP 60 ml Kit核酸純化試劑盒(美國貝克曼庫爾特有限公司)與Qubit dsDNA HS Assay Kit核酸定量檢測試劑盒(美國生命技術公司)對PCR進行純化與量化。依據靶標序列和引物序列獲得原始資料中單個樣本數據，去除靶標及引物序列后使用Vsearch(v2.4.4)對每份樣本的堿基序列進行拼接，得到原始堿基序列。同時對原始堿基序列進行質量控制與過濾，去除低質量序列的標準為：序列<150 bp，平均質量低于20 bp，含有不明堿基序列，存在>80 bp的單核苷酸重復序列，去除嵌合體后最終獲得有效數據。Illumina Novaseq 6000平臺對純化后的細菌16S rRNA gene V4區擴增產物進行測序。

3. 生物信息學分析：基于Sliva128 數據庫，通過Vsearch對代表序列進行物種注釋，獲得操作分類單位(operational taxonomic units，OTU)物種信息，測序數據分析主要使用R軟件包(v3.2.0)和QIIME軟件。QIIME軟件計算OTU水平α多樣性指數、β多樣性指數，及門、屬水平的相對豐度，并生成OTU 水平豐度等級曲線(ranked abundance)。R軟件包 “VennDiagram” 生成韋恩圖。R語言ggplot 繪制屬水平氣泡圖。BugBase細菌表型預測工具，獲取微生物的7類表型信息，比較門水平下不同表型的細菌在各組的組成。

注 a.折線越長表明樣本OTU數目越多，曲線越平緩表明群落的均勻度越高；b.韋恩圖，反映兩組間共有與特有的OTU數目圖1 豐度等級曲線與韋恩圖

注 紅色為對照組，藍色為肺結核組，每一個圓點代表一份樣本，點與點之間的距離大小代表了樣本之間的相似性圖2 β多樣性分析

三、統計學處理

結 果

一、 OTU聚類與統計

57份糞便標本細菌16S rRNA gene V4可變區擴增測序，總共獲得7 432 960條有效序列 (clean reads)，人均130 403條Clean reads。測序平均覆蓋度為(94.51±0.15) %，足以說明樣本所涵蓋的腸道菌群類別。以≥97%的相似序列聚類為1個操作分類單位，表征物種的豐富程度和均勻程度的OTU 豐度等級曲線與兩組間OTU韋恩圖共享情況見圖1。

二、肺結核患者腸道菌群多樣性分析

β多樣性利用主坐標分析(principal，PcoA)的降維分析方法，將所有樣本置于差異可視化的二維坐標系中，這種非限制性排序，以樣本的相似性距離為基礎分析，點與點之間的距離遠近代表樣本之間的差異大小，基于加權距離(weighted unifrac based PcoA)與非加權距離(unweighted unifrac based PcoA)觀察到兩組樣本各自聚類，PERMANOVA算法(R2=0.253，P=0.001)表明肺結核組與對照組腸道菌群構成差異有統計學意義，見圖2。α多樣性指數是用以描述組間腸道菌群種類(多樣性)與數目(豐富度)的指標，其中香農(Shannon)指數、辛普森(Simpson)指數反映群落的多樣性，Chao1指數和ACE指數反映群落的豐富度。對照組與肺結核組相比，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 α多樣性指數在肺結核組與對照組中的比較

三、肺結核患者腸道菌群門水平構成分析

共檢測出17種菌門，其中擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)、TM7、互養菌門(Synergistetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)為隊列中豐度前10位的菌門。擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為優勢菌門，對照組中總占比為98.50%，肺結核組中為93.05%。擬桿菌門對照組中占比為42.74%，肺結核組中為44.84%;厚壁菌門對照組中占比為51.55%，肺結核組中為35.44%；變形菌門對照組中占比為4.21%，肺結核組中為12.77%，見圖3。其中，肺結核組腸道菌群中厚壁菌門(35.44%)明顯低于對照組(51.55%)，差異有統計學意義(Z=-3.290，P<0.01)。

圖3 門水平組間菌群構成差異分析

四、肺結核患者腸道菌群屬水平構成分析

共檢測到253種菌屬，其中肺結核組與對照組差異菌屬共12種，分別為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、臭桿菌屬(Odoribacter)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、Anaerostipes、勞特氏菌屬(Blautia)、糞球菌屬(Coprococcus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、羅氏菌屬(Roseburia)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、真桿菌屬(Eubacterium)，見表3。

表3 腸道菌群屬水平相對豐度在肺結核組與對照組的比較

五、基于BugBase表型分類的腸道菌群功能預測

與對照組比較，肺結核組患者腸道中厭氧菌(Anaerobic)基因相對豐度與革蘭氏陽性菌(Gram-positive)基因相對豐度均降低，兼性菌(Facultatively anaerobic)基因相對豐度與革蘭氏陰性菌(Gram-negative)基因相對豐度均增高，生物膜形成能力(Forms biofilms)的細菌基因相對豐度增高，腸道菌群氧化脅迫(stress tolerant)耐受能力增強。此外，需氧菌(Aerobic)基因相對豐度與具有移動組件(Contains mobile elements)的細菌基因相對豐度升高，具有潛在致病性(Potentially pathogenic)細菌的基因相對豐度增加，但差異無統計學意義，見表4。

表4 腸道菌群表型相對豐度百分比在肺結核組與對照組的比較

討 論

結核病作為一種慢性消耗性疾病，其疾病的預后與人體自身的營養免疫狀況密切相關，腸道作為人體最大的黏膜系統，富含豐富的腸道菌群，腸道菌群通過黏膜免疫系統，以及分泌代謝產物由血液循環到達全身各處，參與宿主的營養免疫調節，對宿主健康至關重要[7]。筆者應用高通量測序技術與生物信息學分析對肺結核患者腸道菌群總體組成與細菌表型進行分析。腸道菌群多樣性研究結果表明，肺結核患者腸道菌群與健康對照者相比α多樣性下降，β多樣性存在明顯差異，這表明在肺結核感染的病理狀態下，患者出現明顯的菌群種類與豐度下降或者定植困難，其原因可能與病原體感染激活全身免疫系統，機體發生應激反應而引起菌群種類與豐度下降有關[8]。

腸道菌群構成分析顯示，擬桿菌門與厚壁菌門為兩組的優勢菌門，占總菌門數的85%以上，其次為變形菌門、梭桿菌門與放線菌門。其中，兩組間差異菌門為厚壁菌門，肺結核患者腸道內厚壁菌門豐度明顯低于健康對照組，這與Wu等[9]對肺結核患者痰標本菌群變化的研究結論一致。厚壁菌門是人類腸道菌群中豐度最高的菌門，占腸道菌群的20.5%～80%，大部分腸道短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)產生菌與益生菌均屬于厚壁菌門[10]。此外，健康人的腸道菌群厚壁菌門比例通常較高[11]。研究表明，若疾病狀態下機體腸道內厚壁菌門比例降低，則會引起胃腸道代謝異常，并導致血液循環系統中SCFAs的濃度降低，進而影響宿主免疫系統和全身炎癥因子的組成[12]。肺結核患者腸道菌群厚壁菌門豐度降低提示肺結核患者腸道菌群紊亂，可能會導致機體免疫功能受損[10]。

兩組間差異菌屬共鑒定出12種，其中雙歧桿菌屬屬于放線菌門，副擬桿菌屬與臭桿菌屬屬于擬桿菌門，梭狀芽胞桿菌屬、Anaerostipes、勞特氏菌屬、糞球菌屬、毛螺菌屬、羅氏菌屬、糞桿菌屬、瘤胃球菌屬、真桿菌屬均屬于厚壁菌門。雙歧桿菌是一種益生菌，研究表明雙歧桿菌在小鼠肺部肺炎克雷伯菌感染中具有促進機體產生抗體和γ-干擾素(INF-γ)，增強自然殺傷細胞活性的有益作用[13]，除了對抗細菌感染，雙歧桿菌還可以通過誘導Treg細胞的產生減輕哮喘小鼠模型的肺部病理改變[14]，這表明肺結核患者腸道雙歧桿菌下降，可能不利于疾病的預后。差異菌屬中SCFAs產生菌包括：梭狀芽胞桿菌屬[15]、毛螺菌屬[16]、羅氏菌屬[16]、瘤胃球菌屬[16]、真桿菌屬[16]、糞桿菌屬[16]、勞特氏菌屬[17]、糞球菌屬[17]、Anaerostipes[18]，其中只有Anaerostipes、真桿菌屬在肺結核組呈現上升的趨勢，其余菌屬均較健康對照組下降，因羅氏菌屬、毛螺菌屬、瘤胃球菌屬為人體腸道內主要的SCFAs產生菌[19]，推測肺結核組腸道內SCFAs產生下降。文獻報道，SCFAs至少通過兩種機制作用于免疫和內皮細胞：激活G蛋白偶聯受體和抑制組蛋白去乙酰化酶，其與各種類型的免疫細胞功能及宿主的免疫應答相關[20]，并可抑制腸道病原體定植，維持腸上皮屏障完整及為腸細胞提供能量[21-22]。在炎癥性腸病、結直腸癌和糖尿病等炎癥相關疾病患者的腸道菌群中也觀察到SCFAs產生菌豐度的降低[23]。結核病患者SCFA產生菌的下降可能表明全身炎癥加劇和全身免疫反應受損，從而對肺結核患者產生不利影響。然而，Segal等[24]發現，艾滋病患者口腔以及肺部的厭氧菌通過發酵SCFAs，從而誘導HIV感染患者外周血調節性T細胞(Tregs)分化，以及抑制外周血單個核細胞中IFN-γ和IL-17A的產生，增加HIV感染患者對MTB的易感性。同樣，Lachmandas等[25]在肺結核與糖尿病共病患者體內發現，丁酸鹽可降低MTB誘導的促炎細胞因子反應，同時增加IL-10的產生，增加宿主感染結核病的風險。因此，SCFAs可能在肺結核與其他疾病共病患者體內發揮不利作用，SCFAs產生菌在肺結核患者，以及在肺結核與其他疾病共病患者體內的具體作用還需進一步研究證實。

BugBase是一種微生物表型預測工具，基于OTU物種信息可對人類腸道菌群的功能進行預測，本研究中BugBase分析結果顯示，肺結核患者腸道菌群生物膜形成能力增強、革蘭氏陰性菌比例增加、氧化脅迫耐受，綜合兩組的氧需求(需氧菌、厭氧菌、兼性菌)表型來看，肺結核患者腸道菌群厭氧菌減少，兼性菌增加，提示肺結核組患者腸道菌群氧耐受能力明顯提高，該能力的提高預示肺結核組患者腸道菌群處于紊亂狀態[26]。正常情況下，腸道是一個高強度的厭氧環境，腸道微生物主要由厭氧菌組成，當腸道理化環境，如pH值、離子濃度、水分、腸道通透性等的改變會引起腸道氧氣增多，而人體腸道內的條件致病菌氧耐受程度遠大于腸道正常菌群[27]，氧動力學在調節腸道動態平衡中起著核心作用，氧梯度的破壞是引起許多腸道疾病的原因，包括炎癥性腸病和大腸癌等[28]。肺結核患者腸道菌群中需氧菌及兼性厭氧菌豐度增高，提示肺結核患者的腸道微生態環境中氧含量的增加，這種改變可能是肺結核患者感染MTB的因素之一。

本研究存在一定的局限性，僅初步發現肺結核患者腸道菌群組成及表型與健康對照者存在區別，尚不能確定這種變化的發生是在MTB感染之前還是之后，后續仍需動物實驗進一步驗證兩者之間的因果關系。并且受試者未進行標準化飲食，而飲食對個體腸道菌群具有一定的影響[29]。同時，由于不是16S全長測序，16S rRNA V4對菌群的分辨率較低，無法鑒定到種水平，且16S是存在于所有細菌中的一段序列[30]，無法鑒定腸道微生物中寄生蟲、病毒、真菌，選擇宏基因組測序可以對樣本中所有微生物進行鑒定。但細菌16S序列具有高度的相似性，對16S rRNA V4區測序，可以將腸道菌群鑒定到屬水平[31]，且其測序成本遠低于宏基因測序，目前仍廣泛應用于鑒定疾病狀態下患者與健康對照者腸道菌群的差異性研究中。

綜上所述，本研究發現在疾病狀態下，肺結核患者存在腸道菌群組成及細菌表型改變，肺結核患者腸道菌群多樣性下降，菌群定植能力低于健康人。菌群組成水平上SCFAs產生菌相關的細菌豐度下降，目前已有研究證明補充益生菌能增強宿主的抗結核免疫力[4]。本研究為探索微生態療法在肺結核疾病中的治療提供了一定的研究思路。