13種抗生素對快生長分枝桿菌的體外抑菌效果評價

于霞 任汝顏 文舒安 梁倩 董玲玲 黃海榮

快生長分枝桿菌(rapidly growing mycobacteria，RGM)是非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)的一種，生長速度較快，在羅氏或7H10培養基上一周內可見菌落生長。近年來，全球RGM感染的發病率在不斷增加[1-2]，但是根據臨床癥狀或影像學特征，通常很難區分RGM感染和結核分枝桿菌感染[3]；膿腫分枝桿菌、龜分枝桿菌和偶發分枝桿菌是最常見的致病RGM。膿腫分枝桿菌是最常見的引起NTM肺病的菌種，約50%的NTM肺病由其引起，臨床癥狀與肺結核相似，難以鑒別。此外，膿腫分枝桿菌也常引起皮膚軟組織和骨關節感染。偶發分枝桿菌與膿腫分枝桿菌類似，既可引起肺病，也可引起皮膚軟組織和骨關節感染[4]。而龜分枝桿菌主要引起人類的皮膚、骨骼和軟組織感染，極少引起肺部感染。近年來，龜分枝桿菌感染也成為外科手術和醫學美容手術常見的伴發感染，如器官移植、整容手術、美容注射吸脂手術及紋身等[5-6]。

由RGM感染引起疾病的治療仍然十分困難，因其對多種一線抗結核藥物天然耐藥[7]。因此，準確的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)對RGM感染致病的臨床治療至關重要。在中國，疑似結核病患者中NTM感染的占比約為6.3%，最常見的RGM感染菌種分別是膿腫分枝桿菌(20.3%)、龜分枝桿菌(10.5%)和偶發分枝桿菌(6.4%)[8]。為此，筆者擬對上述3種我國最常見的RGM臨床分離株和RGM標準株采用Sensititre RAPMYCO藥敏板測定其對13種抗生素的敏感性，以了解其抗生素耐藥特征譜，從而為RGM感染的個體化治療提供重要依據。

材料和方法

1.菌株選擇：收集首都醫科大學附屬北京胸科醫院2015年1月至2019年12月從臨床樣本中分離出的98株RGM，包括25株偶發分枝桿菌、70株膿腫分枝桿菌和3株龜分枝桿菌。這些臨床分離株的患者來源于中國的北方，包括13個省份及北京和天津兩個直轄市。選取在對硝基苯甲酸(500 μg/ml)生長試驗陽性的菌株，進行hsp65、rpoB和16S rRNA、16-23S rRNA基因的測序，將所有臨床分離株鑒定至菌種水平。龜分枝桿菌(ATCC14472)、偶發分枝桿菌(ATCC6481)和膿腫分枝桿菌(ATCC19977)標準株購自美國標準菌株庫(American Type Culture Collection，ATCC)。

2.試劑儀器：藥敏試驗使用Sensititre RAPMYCO 藥敏板(美國賽默飛公司)進行檢測，其可在不需要儀器設備的情況下定量評估臨床分離株對13種抗生素的藥物敏感性[7]。該板是含有凍干抗生素的微孔板，用于檢測RGM菌株的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)[9]。該板含有以下濃度的13種抗生素：阿米卡星，1～64 μg/ml；妥布霉素，1～16 μg/ml；阿莫西林-克拉維酸，2/1 μg/ml～64/32 μg/ml；頭孢西丁，4～128 μg/ml；亞胺培南，2～64 μg/ml；環丙沙星，0.12～4 μg/ml；莫西沙星，0.25～8 μg/ml；克拉霉素，0.03～16 μg/ml；利奈唑胺，1～32 μg/ml；米諾環素，1～8 μg/ml；多西霉素，2～64 μg/ml；替加環素，0.015～4 μg/ml；甲氧芐啶-磺胺甲噁唑，0.25/4.75 μg/ml～8/152 μg/ml。

3.MIC測定：在無菌生理鹽水中制備菌懸液，將其比濁至0.5 麥氏濃度。將50 μl的菌懸液加入10 ml的Mueller Hinton(MH)肉湯培養基，最終接種液細菌載量為1×105～5×105CFU/ml。顛倒混勻后向每孔加入100 μl菌懸液。將100 μl菌懸液轉移到含有13種抗生素的平板的各個孔中。用黏性密封紙密封接種板，并在28～30 ℃培養箱中孵育72 h。如果在對照孔中有菌生長，表現為渾濁或孔底部有沉積物，表示菌量已足夠，記錄各含藥孔的細菌生長情況，第一個抑制細菌生長的藥物濃度，即為MIC值。否則，繼續培養48 h再判讀結果。

4.統計學處理：對實驗菌株的耐藥情況進行描述性分析。

結 果

1.標準菌株的耐藥情況：龜分枝桿菌(ATCC14472)、偶發分枝桿菌(ATCC6481)和膿腫分枝桿菌(ATCC19977)標準株在不同批次實驗中MIC值顯示出高度的可重復性，見表1。

表1 13種抗生素對3種快生長分枝桿菌標準菌株的最小抑菌濃度(μg/ml)

2.龜分枝桿菌臨床分離株的耐藥情況：除有1株龜分枝桿菌臨床分離株的MIC>64 μg/ml表現為對阿米卡星耐藥外，阿米卡星對其余2株龜分枝桿菌的抑菌活性均較好。對于納入的3株龜分枝桿菌臨床分離株，替加環素對其MIC分別為0.12、1、2 μg/ml。但莫西沙星、環丙沙星和利奈唑胺對龜分枝桿菌臨床分離株幾乎沒有抑菌活性。

3.偶發分枝桿菌臨床分離株的耐藥情況：阿米卡星對偶發分枝桿菌的抑菌活性最佳，敏感率為100.0%(25/25)。替加環素也對其表現出優越的抗菌活性，敏感率可達100.0%(25/25)。對于氟喹諾酮類藥物，莫西沙星和環丙沙星均表現出對偶發分枝桿菌臨床分離株高度的體外抑菌活性。但只有4.0%(1/25)納入的偶發分枝桿菌臨床分離株對克拉霉素敏感(表2)。

表2 偶發分枝桿菌臨床分離株的藥物敏感性試驗結果

4.膿腫分枝桿菌臨床分離株的耐藥情況：阿米卡星對膿腫分枝桿菌的抑菌活性最佳，敏感率為90.0%(63/70)；替加環素也對其表現出優越的抑菌活性，敏感率可達到72.9%(51/70)。此外，大多數膿腫分枝桿菌對克拉霉素敏感或中介敏感。但莫西沙星和環丙沙星對膿腫分枝桿菌臨床分離株幾乎沒有抑菌活性。幾乎所有納入的膿腫分枝桿菌臨床分離株均對利奈唑胺耐藥(表3)。

表3 膿腫分枝桿菌臨床分離株的藥物敏感性試驗結果

5.不同藥品對3種RGM耐藥情況比較：阿米卡星對3種RGM均具有很好的體外抑菌效果，對偶發分枝桿菌和膿腫分枝桿菌的敏感率分別為100.0%(25/25)和90.0%(63/70)；3株龜分枝桿菌臨床分離株中，有2株對阿米卡星敏感。替加環素對RGM的體外抑菌效果更好，對偶發分枝桿菌和膿腫分枝桿菌的敏感率分別為100.0%(25/25)和72.9%(51/70)。莫西沙星和環丙沙星對偶發分枝桿菌臨床分離株表現出較強的抑菌活性，敏感率分別為100.0%(25/25)和92.0%(23/25)，而對膿腫分枝桿菌臨床分離株幾乎沒有體外抑菌活性，耐藥率均為95.7%(67/70)。幾乎所有檢測的RGM臨床分離株均對頭孢西丁、多西環素、利奈唑胺、亞胺培南和甲氧嘧啶-磺胺甲噁唑耐藥。

討 論

美國胸科協會對于RGM(龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和偶發分枝桿菌)的推薦治療方案是依據體外藥敏試驗的結果選擇藥物。對于偶發分枝桿菌引起的肺病，推薦使用至少2種以上體外敏感的藥物進行治療，直至痰菌陰轉12個月；對于膿腫分枝桿菌肺病，推薦使用含克拉霉素的多藥物治療方案[4]。實驗室標準化研究所推薦對RGM(包括膿腫分枝桿菌、偶發分枝桿菌、龜分枝桿菌和Fuerth分枝桿菌)應進行以下藥品的藥敏試驗，包括阿米卡星、頭孢西丁、克拉環素、阿奇霉素、亞胺培南、莫西沙星、左氧氟沙星、環丙沙星、多西環素、美羅培南等[10]。本研究所用的RAPMYCO MIC 藥敏板涵蓋了實驗室標準化研究所推薦對RGM藥敏試驗的全部抗生素，其藥敏試驗結果可為RGM感染的治療提供重要依據。

研究顯示，阿米卡星對膿腫分枝桿菌、龜分枝桿菌和偶發分枝桿菌的抑菌活性強，而妥布霉素僅對龜分枝桿菌有效，這與其他研究結果一致[7,11]。與多西霉素/米諾環素相比，替加環素在先前的研究及本研究中均對RGM表現出較低的MIC，目前被認為是一種有前景的藥品[11]。筆者研究數據顯示，幾乎所有納入的臨床分離株均對頭孢西丁、多西環素和甲氧嘧啶-磺胺甲噁唑具有抗性，這與Cavusoglu等[9]研究一致。對于亞胺培南，所有納入的RGM分離株均對其耐藥，這也與先前的研究一致，即偶發分枝桿菌對亞胺培南的敏感率每年都以9.5%的速度下降[12]。本研究中，納入的膿腫分枝桿菌對利奈唑胺的敏感率僅為2.9%，與Hatakeyama等[13]的研究結果不一致，其報告了膿腫分枝桿菌對利奈唑胺的敏感率為76.9%(10/13)。陳品儒等[14]發現廣東地區分離的膿腫分枝桿菌耐藥率呈現逐年增加的趨勢，2010年的敏感率為87.1%(27/31)，而2011年則降為68%(17/25)。隨著利奈唑胺在我國臨床上的廣泛應用，勢必導致耐藥菌株的數量不斷增加。

本研究采用商品化的RAPMYCO MIC 藥敏板檢測RGM的藥物敏感性，該方法已經獲得國家食品藥品監督管理局批準可用于臨床診斷。與傳統的羅氏藥敏試驗相比，RAPMYCO MIC藥敏板無需手工制備不同藥物濃度的培養基，操作簡單；與MGIT 960液體藥敏試驗相比，RAPMYCO MIC藥敏板法成本低、檢測藥物種類更多且可以報告MIC，可以更好地指導臨床用藥。因此，RAPMYCO MIC藥敏板是一種快速、簡單且經濟的藥敏試驗檢測方法。

綜上所述，阿米卡星、替加環素、環丙沙星、莫西沙星和克拉霉素對RGM表現出良好的抑菌活性，此結果可為RGM感染的治療提供參考。目前，RGM感染治療可供選擇的藥物仍非常有限，需要對RGM感染治療方案的優化提供更多的數據。RAPMYCO MIC藥敏板操作簡單，可以方便、快速地檢測出RGM對13種抗生素的敏感性，適合在臨床上常規開展使用。