復配天然保鮮劑對青蝦冷藏保鮮效果的影響

黃 昊，何涓源，賴思婷，陳利忠，馮艷麗，余 翔,*

（1.浙江恒通生物科技股份有限公司，浙江 湖州 313014；2.湖北師范大學生命科學學院，食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002）

青蝦（Macrobrachium nipponense）學名日本沼蝦，是我國及東南亞國家特有的經濟養殖蝦類，其味道鮮美且具有高蛋白、低脂肪的營養特點[1]，深受消費者的青睞，市場需求量逐年擴增，但新鮮青蝦捕獲離水后極易死亡，且由于其肌肉含水量高、營養豐富，在冷藏過程中極易發生腐敗變質[2]，如何延長其冷藏貨架期是青蝦產業發展中面臨的瓶頸問題。

近年來，眾多學者圍繞蝦類生鮮水產品的保鮮開展了大量的研究，研發出天然保鮮劑保鮮[3]、氣調保鮮[4]和輻照保鮮等技術應用于生鮮水產品的保鮮，其中天然保鮮劑以其安全、高效、成本低且容易操作等優點備受研究人員關注，各種具有成膜、抑菌和抗氧化等作用的天然物質如殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物、乳酸鏈球菌素（Nisin）、茶多酚等被逐步開發并應用于生鮮水產品的保鮮中，并取得了較好的保鮮效果。但研究也表明，使用單一天然保鮮劑進行生鮮水產品保鮮時，往往會出現保鮮劑用量過大但保鮮效果有限的現象，且不能有效的抑制或殺死食品中的腐敗和致病微生物。而根據柵欄技術的原理，將不同種類的天然保鮮劑進行復配，可發揮不同天然保鮮劑的協同效應，使保鮮效果大幅提升[5]。

課題組前期通過正交試驗將殼聚糖、卡拉膠、迷迭香提取物和乳酸鏈球菌素（Nisin）四種天然保鮮劑組分進行復配優化，開發出一種適用于青蝦冷藏保鮮的復配天然保鮮劑（殼聚糖12.5 g/L、卡拉膠1.75 g/L、迷迭香提取物0.9 g/L、Nisin 0.7 g/L），該保鮮劑可以大幅延長青蝦的冷藏貨架期。為盡快將該青蝦復配天然保鮮劑應用于生產實際中，本試驗對采用該復配天然保鮮劑涂膜處理的青蝦在冷藏過程中pH 值、揮發性鹽基氮（Total volatile basic nitrogen, TVB-N）、硫代巴比妥酸反應物（Thiobarbituric acid reactive substances,TBARS）值、菌落總數等理化指標進行檢測，同時結合青蝦肌肉蛋白的SDS-PAGE 電泳研究肌肉蛋白質結構和性質的穩定性，全面評價該復配天然保鮮劑對青蝦保鮮效果的影響，為進一步的產業化實施提供理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

本研究所用青蝦來自浙江恒通生物科技股份有限公司養殖基地，捕撈后在青蝦處于鮮活狀態下運輸至實驗室進行后續樣品保鮮處理。

殼聚糖（脫乙酰度＞90%）、迷迭香提取物、卡拉膠和乳酸鏈球菌素（以上均為食品級），購于河南圣斯得實業有限公司；硼酸、氧化酶、硫酸、氫氧化鈉等化學試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

K9860 型全自動凱氏定氮儀，山東海能科學儀器有限公司；BCM-1300A 型生物潔凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；CP114 型電子天平，美國奧豪斯儀器（上海）有限公司；PHS-3C 型pH 計，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 復配天然保鮮劑的配制及樣品處理方法

1.2.1.1 復配天然保鮮劑配制方法

參照課題組前期研究所獲得的復配天然保鮮劑配方（殼聚糖12.5 g/L、卡拉膠1.75 g/L、迷迭香提取物0.9 g/L、Nisin 0.7 g/L）進行配制。根據配方稱取相應質量的殼聚糖粉末，用1%醋酸溶液溶解制成殼聚糖溶液，再按照配方稱取相應質量的迷迭香提取物、卡拉膠和乳酸鏈球菌素溶解于殼聚糖溶液中，攪拌均勻制成復配天然保鮮劑，4 ℃貯藏備用。

1.2.1.2 樣品處理方法

試驗組：將50 尾大小一致的新鮮青蝦洗凈、瀝干，將青蝦在復配天然保鮮劑溶液中浸漬10 min，料液比為1∶2（g/mL）。撈出后于4 ℃瀝干30 min，逐只用小號保鮮袋分裝，4 ℃冷藏備用。

對照組：將50 尾大小一致的新鮮青蝦洗凈、瀝干，分裝至保鮮袋，4 ℃冷藏備用。

冷藏當天，取6 尾清洗、瀝干后的新鮮青蝦，去頭、剝殼后取尾部肌肉進行相關指標測定，所測值作為青蝦原料保鮮初始值。從冷藏第1 天起，每日分別從試驗組和對照組各取6 尾青蝦，取其尾部肌肉進行相關保鮮指標測定。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 pH 值

參照GB 5009.237—2016[6]規定的方法對樣品進行測定。

1.2.2.2 揮發性鹽基氮（TVB-N）值

參照GB 5009.228—2016[7]規定的方法，采用自動凱氏定氮法對樣品進行測定。

1.2.2.3 硫代巴比妥酸反應物含量（TBARS）值

參照GB/T 35252—2017[8]規定的方法對樣品進行測定。

1.2.2.4 菌落總數

參照GB 4789.2—2016[9]規定的方法對樣品進行測定。

1.2.2.5 肌肉蛋白質結構和性質的穩定性檢測

青蝦肌肉蛋白的提取：參考Pang 等[10]的方法，將青蝦尾部肌肉取出絞碎，準確稱取1 g 置于50 mL 離心管中，加入10 mL 50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.2,0.55 mol/L KI）, 勻漿后置于4 ℃搖床上浸提20 h，然后以4 200 r/min 離心30 min，收集上清液即青蝦肌肉蛋白提取液，備用。

肌肉蛋白質SDS-PAGE 電泳：參考Pang 等[10]的方法，采用SDS-PAGE 分析復配天然保鮮劑涂膜處理對青蝦冷藏過程中肌肉蛋白質變化的影響。配制質量分數12%的分離膠和4%的濃縮膠對青蝦肌肉蛋白提取液進行SDS-PAGE 電泳分析, 電泳結束后，經考馬斯亮藍染色，脫色后觀察蛋白質條帶變化。

1.2.3 數據處理

試驗數據采用SPSS 18.0 統計軟件的One-way ANOVA 程序進行數據分析，結果以平均值±標準偏差表示，P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 冷藏過程中青蝦肌肉pH 值的變化

pH 值是衡量肉質新鮮程度的重要依據[11]，復配涂膜試驗組青蝦冷藏過程中pH 值的變化見圖1。青蝦新鮮原料初始pH 值為7.15，在冷藏第1 天，對照組和復配涂膜組青蝦樣品的pH 值均略微下降，可能與冷藏初期青蝦經歷僵直和解僵過程，體內糖原和ATP 分解產生乳酸、磷酸等酸性物質，使得肌肉pH值下降有關[12]，復配涂膜組青蝦pH 值低于對照組，可能是在青蝦涂膜和冷藏過程中，復配天然保鮮劑中的少量醋酸組分滲透進蝦肉所致。從冷藏第2 天開始，兩組青蝦樣品的pH 值均開始呈現上升趨勢。眾多研究證明，在肉品自溶期開始后，肌肉內源及微生物來源蛋白酶的共同作用促使肌肉蛋白質發生降解產生胺類等堿性物質，引起肌肉pH 值上升，是肉品開始腐敗變質的重要特征[13-14]。冷藏的2～8 d，復配涂膜組青蝦肌肉pH 值均低于對照組，說明復配天然保鮮劑中的殼聚糖、迷迭香提取物和Nisin 等抗菌組分對青蝦內腐敗微生物的生長具有抑制作用，延緩了冷藏過程中由于微生物生長導致的青蝦腐敗現象的發生。甘暉等[15]研究表明，殼聚糖和茶多酚等天然保鮮劑能改變南美白對蝦冷藏中的微生物區系，降低腐胺、尸胺等堿性物質含量，抑制南美白對蝦冷藏過程中的品質惡化，本研究結果與其一致。

圖1 4 ℃冷藏期間青蝦肌肉pH 值的變化Fig.1 The variation of muscle pH value of M.nipponense muscle stored at 4 ℃

2.2 冷藏過程中青蝦肌肉TVB-N 值的變化

TVB-N 是動物源水產品在酶和微生物的作用下，使其肌肉蛋白質發生腐敗而分解產生的氨及胺類等堿性物質，是評價動物性水產品新鮮程度的重要參數之一[16]。我國相關水產品衛生標準規定，淡水魚蝦TVB-N≤20 mg/100 g 為可接受范圍，其中TVB-N≤10 mg/100 g 為一級鮮度標準[17]。復配涂膜試驗組青蝦冷藏過程中TVB-N 值的變化見圖2。新鮮青蝦TVB-N 值為6.80 mg/100 g，符合一級鮮度要求。冷藏過程中對照組和復配涂膜組的TVB-N 值均呈上升趨勢。冷藏第4 天時，對照組青蝦的TVB-N 值達到20.40 mg/100 g，已失去食用價值，而復配涂膜組在冷藏第7 天其TVB-N 值為19.49 mg/100 g，仍在國家標準的限定范圍內。該結果表明，在青蝦冷藏過程中，復配天然保鮮劑抑制了微生物的生長繁殖，降低了因微生物腐敗造成的氨和胺類等堿性物質的產生，延長了青蝦冷藏貨架期。Liu 等[18]將殼聚糖、丁香精油和曲酸復配涂膜南美白對蝦，在冷藏過程中，試驗組青蝦TVB-N 值的增長被抑制，這與殼聚糖能抑制腐敗微生物的生長，進而延緩肌肉蛋白質腐敗降解有關。相關的一些研究也證明，迷迭香提取物[19]和Nisin[20]具備較好的抑菌性能，用于水產品冷藏中具有較好的保鮮效果。

圖2 4 ℃冷藏期間青蝦肌肉TVB-N 值的變化Fig.2 The variation of muscle TVB-N value of M.nipponense stored at 4 ℃

2.3 冷藏過程中青蝦肌肉TBARS 值的變化

水產品肌肉中含有大量不飽和脂肪酸組分，在冷藏過程中容易發生脂肪氧化進而影響水產品感官和肉質品質，因此，在水產品冷藏過程中控制其脂肪氧化程度是保鮮的關鍵。硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid, TBA）可與脂質氧化產生的的丙二醛（Malondialdehyde,MDA）形成穩定的紅色物質，通過顯色反應可以定量評價水產品脂肪氧化的程度[21]。目前，我國尚沒有明確規定水產品中TBARS 限量標準，但國外相關研究推薦水產品中丙二醛的含量閾值為1～2 mg/kg[22]。復配涂膜試驗組青蝦冷藏過程中TBARS值的變化見圖3。隨著冷藏時間的延長，對照組和復配涂膜組青蝦的TBARS 值均呈上升趨勢，但復配涂膜組青蝦的TBARS 值始終低于對照組。冷藏第6 天時，對照組青蝦肌肉TBARS 值達到2.04 mg/kg，超過建議限量標準；而復配涂膜組青蝦冷藏第8 天，其TBARS 值為1.81 mg/kg，仍在建議限量范圍內。以上結果表明，該復配天然保鮮劑處理能有效延緩青蝦肌肉中的脂肪氧化速率，有利于青蝦的冷藏保鮮。分析原因有以下兩點：首先，復配天然保鮮劑中的殼聚糖組分具有良好的成膜性，能在青蝦表面形成致密的可食性膜，隔絕了青蝦肌肉與氧氣的接觸。其次，復配天然保鮮劑中迷迭香提取物富含迷迭香酚、鼠尾草酚和鼠尾草酸等組分，對脂肪的抗氧化效果良好。Ozogul等[19]和劉金昉等[23]的研究也證明了這一觀點。

圖3 4 ℃冷藏期間青蝦肌肉TBARS 值的變化Fig.3 The variation of muscle TBARS value of M.nipponense stored at 4 ℃

2.4 冷藏過程中青蝦菌落總數的變化

微生物生長是水產品冷藏過程中發生腐敗變質的主要原因，菌落總數是評價水產品腐敗程度的重要依據。Cai 等[24]和Manju 等[25]研究表明，水產品中菌落總數的衛生標準限量值為7 lg(CFU/g)，并建議將該值作為評價水產品貨架期終點的標志。復配涂膜試驗組青蝦冷藏過程中菌落總數的變化見圖4。隨著冷藏時間的延續，對照組和復配涂膜組青蝦的菌落總數均呈上升趨勢，且復配涂膜組始終低于對照組。冷藏第6天，對照組青蝦菌落總數就已達到7.17 lg(CFU/g)，說明青蝦已不具備食用價值，而復配涂膜保鮮組青蝦在冷藏第8 天時，其菌落總數為6.81 lg(CFU/g)，仍在衛生限量標準范圍內，可見該復配天然保鮮劑對青蝦冷藏過程中微生物的生長繁殖起到較好的抑制效果，有利于青蝦的冷藏保鮮。分析原因可能是由于新鮮青蝦經過復配天然保鮮劑涂膜處理后，保鮮劑中的Nisin組分能夠有效抑制微生物的生長，再加之殼聚糖在青蝦表面形成的可食性膜可最大化地隔絕蝦體與空氣的接觸，抑制好氧微生物的生長。研究表明，鮮蝦原料中腐敗菌主要以假單胞菌、氣單胞菌、不動桿菌和黃桿菌等好氧微生物為主[26-28]，據此推斷本研究采用的復配天然保鮮劑對青蝦原料具有非常好的抑菌效果，能極大地延緩冷藏過程中青蝦的腐敗變質速度。

圖4 4 ℃冷藏期間青蝦肌肉菌落總數的變化Fig.4 The variation of total bacterial count of M.nipponense stored at 4 ℃

2.5 冷藏過程中青蝦肌肉蛋白質SDS-PAGE 的變化

水產品在冷藏保鮮過程中，受到內源和微生物來源的蛋白酶共同作用，其肌肉蛋白質會發生降解產生分子量較小的蛋白質、肽類和氨基酸等，導致水產品腐敗變質，因此，可以根據肌肉蛋白質SDS-PAGE 中蛋白條帶的變化來判斷水產品的新鮮程度。圖5 所示，隨著冷藏時間的延長，對照組中肌球蛋白重鏈和副肌球蛋白條帶均逐步變細，在第5 天兩條蛋白質條帶輪廓已不明顯，第8 天均消失。肌動蛋白和肌動蛋白輕鏈條帶在第1 天后基本看不到輪廓，原肌球蛋條帶在整個冷藏期間不斷變淺。說明在冷藏過程中，對照組青蝦肌肉大分子蛋白質不斷降解，青蝦品質變劣。姚潔玉等[29]對凡納濱蝦的保鮮研究也顯示同樣的結果。復配涂膜組青蝦蛋白圖譜中a、b、c、d、e 這5 條蛋白條帶在整個冷藏期間變化不明顯，說明復配保鮮劑處理能夠延緩青蝦肌肉蛋白質降解，有利于其冷藏保鮮。陳賽等[30]研究表明，殼聚糖、茶多酚和溶菌酶的復配保鮮劑能夠維持草魚肌肉蛋白質的結構和性質的穩定性，從而延緩冷藏過程中草魚肌肉質量的下降，本研究結果與之相似。

圖5 4 ℃冷藏期間青蝦肌肉蛋白質的SDS-PAGE 圖譜Fig.5 SDS-PAGE pattern of muscle proteins of M.nipponense stored at 4 ℃

3 結論

采用復配天然保鮮劑（殼聚糖12.5 g/L、卡拉膠1.75 g/L、迷迭香提取物0.9 g/L、Nisin 0.7 g/L）處理青蝦，并在4 ℃冷藏，青蝦的pH 值、TVB-N 值、TBARS值和菌落總數均大幅低于對照組，說明該復配天然保鮮劑能夠有效抑制青蝦冷藏過程中肌肉蛋白質的分解、脂肪的氧化酸敗和微生物的增殖，青蝦冷藏過程中肌肉蛋白質SDS-PAGE 結果也證明，復配天然保鮮劑有利于維持青蝦肌肉蛋白質的結構和性質的穩定性，從而延緩青蝦的腐敗變質，保鮮效果十分明顯。本研究在證明該復配天然保鮮劑的合理性和科學性的同時，也為其他基于殼聚糖涂膜的復配天然保鮮劑開發提供研究思路和借鑒。