親水色譜在食品內源組分分離分析方面的應用進展

邢倩倩，劉振民，游春蘋

（乳業生物技術國家重點實驗室，上海乳業生物工程技術研究中心，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海 200436）

親水色譜是一種類似于正相色譜保留模式的分離手段，主要以水（2%～40%）和乙腈（大于60%）作為流動相在極性固定相表面完成目標物質分離。親水色譜固定相主要以硅膠或有機聚合物等為載體，通過衍生化上氨基、氰基、二醇基、酰胺基、聚(琥珀酰亞胺)基、糖基及兩性離子基團構成[1]。乙腈是親水色譜模式下最常用的有機流動相，甲醇和其他低質子數的醇可作為有機流動相與親水性能較好的固定相結合使用[1]。親水色譜流動相中常用的緩沖鹽為甲酸銨、乙酸銨等揮發性鹽，該類緩沖鹽與質譜、蒸發光散射檢測器和電噴霧檢測器具有較好的適應性。

親水色譜主要通過極性化合物在高比例有機溶劑的流動相和極性固定相表面的富水層之間的分配作用來實現分析物的保留。親水色譜保留作用機理不僅僅是液液分配，還包括離子作用、氫鍵作用和偶極-偶極作用表現出來的吸附作用[2]。固定相、流動相、分析物以及它們的共同作用（例如固定相-流動相、固定相-分析物、流動相-分析物和固定相-流動相-分析物）等次級作用也會影響親水色譜保留機理[3]。通常判斷一個化合物是否適合親水色譜分離的經驗法則就是這個物質是否在反相色譜沒有保留，同時這個化合物是否為極性親水物質（比如logKow 和logD 為負值）。

本文圍繞親水色譜在食品內源組分（核苷堿基、核苷、核苷酸，氨基酸、多肽和蛋白質，磷脂酰膽堿類化合物，碳水化合物，維生素）分離分析方面的應用展開討論，以期為食品中未知成分的分離分析提供參考。

1 親水色譜在食品核苷堿基、核苷和核苷酸分離分析方面的應用

核酸堿基、核苷和核苷酸是一類親水、強極性、不易揮發的有機分子，在中性流動相體系中易轉化為陰離子，因此有學者在反相模式下使用離子對和離子交換色譜完成該類化合物的分離分析[4]。液相色譜和毛細管電泳色譜在核酸堿基、核苷和核苷酸的分離分析方面已有應用[5-8]。但是毛細管電泳色譜所用的流動相與離子檢測手段（如質譜）無法兼容。親水色譜能夠克服已有技術的局限應用于植物來源和動物來源的核酸堿基、核苷和核苷酸的識別和定量分析。

1.1 果蔬及其相關制品

銀杏的果和葉作為膳食補充劑應用廣泛。Yao 等[8]和Zhou 等[9]采用親水色譜串聯MS/MS 檢測手段在MRM 模式下分別完成銀杏果和銀杏葉中核酸堿基和核苷的定量。通過使用核酸堿基和核苷作為標志物可將22 種銀杏葉樣品按照其原產地分為兩大類。

周翔等[10]建立親水色譜串聯三重四級桿質譜法同時測定酸棗仁中11 種核苷及堿基類成分的含量。色譜柱填料為鍵合酰胺基的亞乙基橋雜化硅膠顆粒。該方法適用于酸棗仁中核苷及堿基類成分的快速定量分析。

1.2 嬰兒食品

親水色譜在嬰兒食品中核苷類物質的分離分析方面應用較廣。有學者使用氧化鋁和錫中空纖維膜對樣品中目標化合物進行富集后，結合親水色譜串聯二極管紫外檢測器完成人乳和嬰兒配方乳中5-單核苷酸的定量。該方法在定量分析嬰兒奶粉中的胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、肌苷和單磷酸鳥嘌呤核苷均具有良好表現[7,11]。有學者采用稀釋、高速離心和樣品洗脫后使用親水離子對和親水色譜串聯MS/MS 完成16 種含乳嬰兒食品和非含乳嬰兒食品中的20 種核苷和核苷酸進行分離檢測。該方法在9 min 的梯度洗脫時間內完成核苷、單磷酸核苷酸、二磷酸核苷酸和三磷酸核苷酸的分離檢測[12]。定量限優于其他毛細管電泳和電噴霧質譜以及納米液相色譜紫外方法[5,7]。

1.3 其他食品基質

有學者建立同時測定16 種核苷堿基和核苷的分析方法用來完成8 個批次不同產地和種屬的靈芝樣品的質量評價。柱溫25 ℃下，流動相為包含15 mmol/L乙酸銨的乙腈水（V∶V=5∶95）梯度洗脫可得到最好的分離效果，且可串聯質譜和紫外檢測（254 nm），該方法可成功區分不同產地和種屬的靈芝[13]。

綜上所述：核苷堿基、核苷和核苷酸作為食品內源物質，其含量較高，均為小分子強極性化合物，且大部分結構包含共軛雙鍵，對檢測器無特殊要求，常規紫外檢測器即可滿足檢測要求；使用親水色譜串聯紫外檢測方法可應用于不同食品基質中核苷堿基、核苷和核苷酸的定量定性分析。

2 親水色譜在食品氨基酸、多肽和蛋白質分離分析方面的應用

蛋白質、磷蛋白質和糖蛋白質可直接用親水色譜或經典排阻液相色譜完成分離[14]。在開發該類方法過程中，親水色譜的流動相為高比例有機相，但是這種溶劑環境下蛋白質易發生沉淀，導致溶解性不匹配。有關氨基酸含量測定的分析方法，包括不需衍生化的直接分析方法和涉及分離純化和衍生化的非直接分析方法[15-16]。親水色譜串聯質譜檢測器最常見用于定性定量分析食品中自由氨基酸和活性肽。

2.1 動物來源食品

肉類、海鮮、牛奶和乳制品是膳食中蛋白質的主要來源。動物來源的蛋白質比植物蛋白質結構更復雜。動物蛋白包含大量未知化合物，如小分子蛋白和生物活性肽，其含量可從百分比數量級到百萬分比數量級。

2.1.1 雞湯

Macia 等[17]選擇非功能性亞乙基橋雜化顆料填充柱作為親水柱對雞湯中的肌肽和鵝肌肽進行分析研究，并與兩款相同規格的C18柱分離效果對比。該色譜方法在親水色譜柱10 min 內完成，分離效果優于反相色譜和離子交換反相色譜。

2.1.2 肉制品

Broncano 等[18]采用親水色譜串聯MS/MS 用于分析西班牙臘腸提取物中具有抗氧化活性的親水小分子化合物（自由氨基酸、二肽、三肽以及肉毒堿、肌肽、鵝肝肽、?；撬岷鸵恍┬》肿游⒘炕衔锶缂∷峄蚶i氨酸）。分析條件為在兩性離子固定相用6.7 mmol/L乙酸緩沖鹽和乙腈的流動相梯度洗脫。

2.1.3 海鮮

Tsochatzis 等[19]對冷凍干燥后的紫貽貝中21種氨基酸展開研究，前處理后得到的樣品使用鍵合氨基的亞乙基橋雜化硅膠顆粒色譜柱進行分離分析串聯二級質譜檢測。該方法具有理想的線性相關關系、精密度、回收率和靈敏度，回收率和準確度也符合定量要求。

二肽精氨酰（咸味增強劑）可以使用親水色譜方法在氨基柱上完成分析過程。該方法成功應用于實驗室合成樣品、商業水解樣品以及發酵魚子醬樣品中二肽精氨酰的定量分析[20]。

2.1.4 牛奶

趙瑞等[21]建立牛乳中未衍生游離氨基酸的超高效液相色譜串聯質譜的測定方法。前處理后得到的樣品使用硅膠親水柱進行分離分析。流動相為含10 mmol/L 甲酸銨的水和含2 mmol/L 甲酸銨和3%水的乙腈（均含有0.15%甲酸）。該方法可在14 min 內將所分析目標物較好分離。

2.2 蔬菜、水果、種子及其相關產品

桃核中含具有抗氧化活性的多肽類化合物，提取多肽過程包括磨粉、脫脂、提取，然后通過加入冷丙酮并放入冰箱，蛋白質可從上清液中析出，接下來將蛋白質進行酶水解，然后使用超濾濾出多肽提取物。肽段信息可經過親水色譜柱（未鍵合硅膠柱）分離或反相色譜（鍵合C18固定相硅膠柱）分離后通過電噴霧-飛行時間質譜獲得，檢測到18 種含高比例親水氨基酸的肽[22]。

2.3 液體食物和飲料

Gokmen 等[23]采用親水色譜串聯軌道離子肼質譜用6 min 時間對液體食品（啤酒、果汁、葡萄酒、茶和蜂蜜）中的22 種氨基酸進行分離分析。將樣品用乙腈水（V∶V=1∶1）稀釋過濾后直接進樣即可。流動相為水和添加0.1%甲酸的乙腈，色譜柱為非鍵合硅膠填料柱。

綜上所述，氨基酸、多肽和蛋白質均為強極性物質，其分子量分布較廣，該類物質主要使用親水色譜串聯質譜完成檢測。

3 親水色譜在食品磷脂酰膽堿類化合物分離分析方面的應用

近些年，膽堿類和磷脂類化合物在食品中的重要性越來越明顯，相關的分離分析方法研究也越來越多。核磁共振磷譜在定性定量分析食品中含磷化合物的含量方面表現優異，也能夠對磷脂的同源物進行分析[24-25]。液相色譜串聯熒光檢測器、質譜檢測器和蒸發光散射檢測器以及氣相色譜串聯質譜檢測器在膽堿類化合物和磷脂分離分析方面均有應用，但是尚未有同時定量所有膽堿類化合物和所有磷脂的分析方法[26]。有學者用正相色譜串聯質譜分析膽堿類化合物和磷脂，盡管磷脂和膽堿類化合物具有較好的保留和分離度，但是由于流動相為非極性溶劑，不適合用電噴霧質譜作為檢測器[27]。反相色譜串聯質譜可分離特定的不同酰基鏈長度和不同不飽和度的磷脂酰膽堿類物質。

3.1 動物來源食品

3.1.1 蛋黃

Zhao 等[28]使用非鍵合硅膠柱在流動相為乙腈和甲酸銨的水體系下對蛋黃中的膽堿類物質完成分離定量。該方法還可用質譜根據分子量和碎片信息區分同一類化合物的不同種。該課題組還建立了一種均相萃取法，用于提取食品和生物樣品中8 種磷脂同系物和6 種水溶性膽堿類化合物，該萃取法得到的樣品可直接進入質譜檢測器[29]。

3.1.2 海鮮

Shen 等[30]自制TiO2鍵合硅膠填充SPE 柱，經過SPE 處理后提取，選擇親水色譜串聯高分辨質譜研究蝦醬中的磷脂組成。在流動相分別為乙腈和pH 值為4.0～4.5 的甲酸水溶液、60 mmol/L 甲酸銨水溶液和pH 值為3.6 的53 mmol/L 甲酸水溶液組成下，使用二醇基色譜柱分析檢測到69 種磷脂類物質。該色譜柱可用于分析檢測經SPE 處理后5 種海馬提取物中的50 種磷脂同系物，所用的分析條件為50 ℃柱溫，梯度洗脫，流動相為10 mmol/L 甲酸銨和0.2%甲酸的水溶液及0.2%甲酸的乙腈溶液[31]。

3.1.3 牛奶

Russo 等[32]采用流動相pH 為5.5 對磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿和鞘磷脂在非鍵合硅膠色譜柱上進行分離，檢測器為蒸發光散射檢測器。該分離方法還可串聯離子肼-飛行時間質譜檢測器用于不同化合物的定性。

Liu 等[33]通過親水色譜串聯質譜對32 種牛奶樣品進行分析，定性出70 種不同的極性脂，其中22 個物質為首次報道。

3.2 果蔬、豆類及其相關制品

何秀梅等[34]建立親水色譜串聯質譜法測定圓椒中磷脂含量，分別以磷脂酰膽堿、溶血磷脂乙醇胺、溶血磷脂膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰甘油酸、溶血磷脂絲氨酸為對照進行相對定量。

Lewis 等[35]研究北美豆類中的游離膽堿和膽堿類物質（甘油磷酰膽堿、磷酸膽堿、鞘磷脂、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿）含量，對比烹調前后營養磷脂含量的變化。所用分析方法為非鍵合實心硅膠色譜柱分離串聯質譜檢測，二元流動相為乙腈和pH 為3.0 的10 mmol/L 甲酸銨水溶液，分析時間為30 min，該方法可合理地分離檢測目標化合物。Verardo 等[27]對在4 ℃下保存12 h 的初級鮮榨橄欖油中的磷脂和磷脂丟失進行定量分析。該分析方法在非鍵合實心硅膠色譜柱上完成，使用電噴霧飛行時間質譜檢測器進行檢測。所建立方法可通過定量分析磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和溶血磷脂酰用于橄欖油的磷脂譜表征。

綜上所述，磷脂膽酰類化合物為強極性物質，分子量范圍廣泛，由于該類物質包含磷酸基團，因此磷脂膽酰類化合物的分離分析方向一直是難點，親水色譜串聯質譜手段可有效解決該難點。

4 親水色譜在食品碳水化合物分離分析方面的應用

親水色譜串聯不同檢測技術作為最適宜于糖類化合物分離分析的手段，其通過性可與光譜法結合化學計量分析法的直接分析方法比擬[36]。其他分析手段如核磁、電化學分析和氣相色譜法等，存在靈敏度不足、重現性差和需要衍生等劣勢。

4.1 動物來源食品

Liu 等[37]采用親水色譜串聯軌道離子肼質譜方法，通過使用二醇基色譜柱同時分離牛乳中13 種寡糖。該方法使用水蘇糖和毛蕊花糖作為中性低聚糖類似物，3 種酸性低聚糖包括3-唾液乳糖（3-sialyllactose）、6-唾液乳糖（6-sialyllactose）和6-唾液氨基乳糖（6-sialyl-lactosamine）作為參考標準物質。該方法成功應用于由3 種不同飲食飼養的牛所產的32 份牛乳樣品，所得數據證明不同牛乳中寡糖譜的變化與其中主要的寡糖密切相關。

Martín-Ortiz 等[38]選擇親水色譜串聯質譜在氨基修飾固定相上分離和定量主要的寡糖，并在山羊初乳中發現新天然活性寡糖。該研究考察了梯度條件、柱溫和流動相中不同種類改性劑對分離結果的影響，確定最佳分離條件為：流動相為乙腈和0.1%氨水溶液，柱溫40 ℃。該研究首次通過質譜分離鑒定出山羊初乳中的78 種寡糖化合物，對比山羊乳、牛乳和人乳中的寡糖譜，并揭示山羊初乳可作為天然寡糖的有效來源。

4.2 果蔬、農作物及其相關制品

Ghfar 等[39]選擇超高效液相色譜串聯質譜法用于同時測定棗提取物中果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的含量。經過條件優化，在氨基柱上梯度洗脫，7 min 內完成分離分析。流動相為乙腈和0.1%氨水的水溶液，流速為0.4 mL/min。

Ouerdane 等[40]選擇氨基固定相色譜柱對硒糖進行分離分析，并用電噴霧軌道離子肼質譜進行表征，首次對富硒土地種出的農作物提取物如小麥、大米和玉米中的硒糖進行定量分析，該方法還可用于分析黑介種子和蕓苔屬蔬菜中的硒糖。

4.3 其他食品基質

有學者選擇親水色譜串聯質譜分析液體樣品如葡萄酒、啤酒、牛奶、果汁和植物提取物中的單糖、二糖和寡糖混合物[37,41]。選擇離子交換和離子排阻色譜去除酚醛類化合物和多糖后，制備得到寡糖類組分。每個組分首先在氨基磺酸基鍵合硅膠色譜柱分析，均用電噴霧質譜和離子肼質量分析器處理[42]。

Kotoni 等[41]使用親水色譜新型固定相從啤酒中分離出單糖、二糖和麥芽糖等低聚物。該固定相選擇2.5 μm 全多孔硅膠經過一鍋法和封端技術處理，表面鍵合橋連雙尿基和自由氨基酸。與傳統色譜柱如乙基橋鍵合氨基雜化硅膠和純實心硅膠相比，該固定相具有更好的分離性能和峰型。

夏碧琪等[43]建立親水相互作用色譜-串聯質譜法測定葡萄酒中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、氯化葡萄糖苷芍藥素、飛燕草素葡萄糖苷和氯化錦葵色素-3-O-葡糖苷4 種花青素的分析方法。該方法選擇的色譜柱為兩性離子修飾硅膠色譜柱，流動相為乙腈和20 mmol/L 乙酸銨溶液，目標化合物在梯度洗脫條件下采用多反應監測模式進行檢測。

綜上所述，糖類化合物為強極性物質，分子量范圍廣泛，親水色譜在糖類化合物分離分析方面應用較廣泛。

5 親水色譜在食品維生素分離分析方面的應用

親水色譜在水溶性維生素的分離分析上具有較大優勢。陳翔等[44]建立親水色譜串聯三重四級桿質譜法，對白茶鮮葉中氨基酸、核苷酸、維生素和輔酶、糖類和甘油磷脂類等小分子代謝物進行靶向代謝譜分析，旨在了解白茶萎凋過程中代謝物的變化規律及其對白茶品質的影響，并為白茶萎凋工藝技術參數的確定提供分子水平的理論依據。該方法使用亞乙基橋鍵合氨基硅膠柱，流動相為添加25 mmol/L 乙酸銨和25 mmol/L 氨水（pH=9.75）水溶液和乙腈，整個分析過程耗時23 min。吳昊等[45]建立親水色譜串聯紫外檢測器分析飲料中VC 含量。該方法采用氨丙基鍵合硅膠色譜柱，流動相為0.02 mol/L 磷酸二氫鉀水溶液和甲醇，檢測波長為249 nm。使用該方法進行分析時VC化合物的保留時間在9 min 左右，能夠克服VC 在反相色譜柱上保留不足的問題，有效分離飲料樣品中的雜質，獲得尖銳、對稱性好的目標峰。

綜上所述，維生素為小分子強極性物質，親水色譜可與反相色譜結合應用于維生素的分離分析。

6 展望

親水色譜在分離強極性和離子型化合物方面的優勢使其在食品內源組分方面可與反相色譜互補應用。親水色譜在食品內源組分的分離分析方面應用越來越廣，已被廣泛認為是一種可用于食品質量控制分析的方法。未來，親水色譜可與食品組學結合用于詳細闡述食品的物質基礎，同時也可應用于人體代謝產物和腸道微生物代謝產物的分離分析。