纖維素酶輔助提取牛蒡多糖及牛蒡復合保健茶飲料的研制

董玉瑋，苗敬芝,*

（1.徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇 徐州 221018；2.江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221018）

牛蒡為菊科牛蒡屬草本植物，又名東洋參、大力子等，具有“蔬菜之王”的美稱[1-2]。其主要食用部分是牛蒡根，富含多糖、膳食纖維、多酚、維生素、氨基酸、鈣、鐵等人體所需的營養素，具有多種功效[3-6]。其中牛蒡多糖是其重要的活性成分，研究表明，牛蒡多糖具有抗氧化、抗癌、抗菌消炎、清除體內自由基、降血糖、降血脂、防治糖尿病、促進鈣的吸收、預防骨質疏松、增強機體免疫力等作用[7-9]，因而引起廣泛的關注。我國牛蒡資源充足，現有加工產品牛蒡醬菜、牛蒡酥、牛蒡糊等[10]，加工利用程度不高，手段粗放，難以滿足現階段牛蒡整個產業鏈的發展和需求。牛蒡飲料的生產在我國還處于起步階段，在飲料市場中還較少見。隨著社會經濟的發展，人民生活水平的提高，消費者對飲料的喜好和需求發生了巨大的變化，正向著營養、健康、綠色、安全方向發展，將牛蒡和其他具有保健作用的原料結合，開發研制出功能保健飲料，是牛蒡深加工的研究方向。本試驗以牛蒡為原料，采用纖維素酶輔助提取牛蒡多糖，利用酶的專一性、高效性、反應條件溫和等優點，通過單因素和正交試驗優化提取工藝條件，以牛蒡多糖提取液為基礎與制備的玫瑰花汁、紅茶汁、檸檬酸等按一定比例調配，研制出一種集保健、美容養顏、提神醒腦的茶飲料[11-12]，以滿足消費者對綠色、健康茶飲料的需求，為牛蒡的綜合開發利用和提高產品附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

牛蒡、玫瑰花茶、紅茶、蜂蜜、白砂糖等購于徐州市易初蓮花超市。

纖維素酶（50 000 U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；苯酚、硫酸、檸檬酸、β-環狀糊精、黃原膠、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀等均為分析純試劑。

1.1.2 儀器與設備

DHG-9075A 型電熱鼓風干燥箱，上海慧泰儀器制造有限公司；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；L-550 型低速臺式離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；W14564 型可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，上海博訊實業有限公司；IXQ-SG46-280A 型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療機械廠。

1.2 方法

以下方法中牛蒡多糖提取液、玫瑰花汁、紅茶汁的添加量以占牛蒡復合保健茶飲料的體積百分比表示，檸檬酸、白砂糖、蜂蜜、β-環狀糊精、黃原膠的添加量以占牛蒡復合保健茶飲料的質量體積百分比表示。

1.2.1 牛蒡多糖的提取

1.2.1.1 工藝流程

新鮮牛蒡→清洗、去皮→切片、護色（0.5%抗壞血酸+0.5%檸檬酸）（質量體積百分比）→50 ℃烘干→破碎、過篩→稱樣、按料液比1∶25（g/mL）加0.1 mol/L、pH 4.8 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液→加纖維素酶→酶解→加熱滅酶→離心→上清液→苯酚-硫酸法測多糖含量[13]

1.2.1.2 葡萄糖標準曲線的繪制

準確稱取烘干的葡萄糖0.1 g，配制成1 000 mL溶液，終濃度為0.1 mg/mL。

分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 標準葡萄糖溶液，于10 mL 比色管中，加去離子水補至4.0 mL，加6%苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻，避光反應25 min，在490 nm 處測吸光度，以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標，以吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，如圖1 所示。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.2.1.3 牛蒡多糖得率及多糖提取液濃度的測定

稱取1 g 左右牛蒡粉，按料液比1∶25（g/mL）加入0.1 mol/L pH 4.8 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，按酶與牛蒡粉的質量百分比加纖維素酶，放入一定溫度水浴鍋中，酶解一定時間，90 ℃滅酶10 min，酶解后溶液放入離心機中離心，轉速4 000 r/min，時間25 min，上清液即為牛蒡多糖提取液。用移液管取上清液1.0 mL，加去離子水稀釋至1 000 mL，苯酚-硫酸法測定溶液的吸光度[13]，根據葡萄糖標準曲線計算樣品中牛蒡多糖質量，并通過以下公式計算牛蒡多糖得率及多糖提取液濃度。

1.2.1.4 牛蒡多糖提取工藝優化的單因素試驗

在酶添加量2.5%（酶與牛蒡粉的質量百分比，以下同），酶解溫度50 ℃的條件下，分別考察60、90、120、150、180 min 酶解時間對多糖得率的影響；在酶解時間120 min，酶解溫度50 ℃的條件下，考察酶添加量分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%時對多糖得率的影響；在酶解時間120 min，酶添加量3.0%的條件下，考察酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃時對多糖得率的影響。

1.2.1.5 牛蒡多糖提取工藝優化的正交試驗設計

基于單因素試驗結果，利用L9(34)正交試驗考察酶解時間、酶添加量、酶解溫度對牛蒡多糖得率的影響，因素水平設計見表1。

表1 牛蒡多糖提取正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factors level table for burdock polysaccharide extraction

1.2.2 牛蒡復合保健茶飲料的制備

1.2.2.1 玫瑰花汁、紅茶汁的制備

玫瑰花汁：稱取一定量優質玫瑰花，按料液比1∶50（g/mL）加入85 ℃去離子水，浸泡20 min，冷卻至室溫，真空抽濾，濾液備用。

紅茶汁：稱取一定量優質紅茶，按料液比1∶50（g/mL）加入85 ℃去離子水，浸泡20 min，冷卻至室溫，真空抽濾，濾液備用。

1.2.2.2 牛蒡復合保健茶飲料的制備工藝流程

牛蒡多糖提取液→添加玫瑰花汁、紅茶汁、檸檬酸，按一定比例調配→添加甜味劑（0.5%蜂蜜+6%白砂糖）→添加穩定劑（0.25% β-環狀糊精+0.1%黃原膠）→均質→灌裝、封口→高溫滅菌→冷卻→牛蒡復合保健茶飲料成品[14-15]

1.2.2.3 牛蒡復合保健茶飲料配方優化的單因素試驗

以感官評價作為評定指標，以牛蒡多糖提取液、玫瑰花汁、紅茶汁和檸檬酸作為調配劑進行單因素試驗，重復3 次，結果取平均值。在添加玫瑰花汁15%，紅茶汁14%，檸檬酸0.15%的條件下，分別加入4%、8%、12%、16%和20%的牛蒡多糖提取液，混勻，靜置1 d，進行感官評分，考察牛蒡多糖提取液添加量對牛蒡復合保健茶飲料感官評分的影響。

在添加牛蒡多糖提取液12%，紅茶汁14%，檸檬酸0.15%的條件下，分別加入5%、10%、15%、20%和25%的玫瑰花汁，混勻，靜置1 d，進行感官評分，考察玫瑰花汁添加量對牛蒡復合保健茶飲料感官評分的影響。

在添加牛蒡多糖提取液12%，玫瑰花汁20%，檸檬酸0.15%的條件下，分別加入6%、10%、14%、18%和22%的紅茶汁，混勻，靜置1 d，進行感官評分，考察紅茶汁添加量對牛蒡復合保健茶飲料感官評分的影響。

在添加牛蒡多糖提取液12%，玫瑰花汁20%，紅茶汁14%的條件下，分別加入體積百分比為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的檸檬酸，混勻，靜置1 d，進行感官評分，考察檸檬酸添加量對牛蒡復合保健茶飲料感官評分的影響。

1.2.2.4 牛蒡復合保健茶飲料配方優化的正交試驗設計

基于單因素試驗結果，以牛蒡多糖提取液、玫瑰花汁、紅茶汁、檸檬酸添加量為影響因素，以感官評分為指標，進行L9(34)正交試驗，因素水平設計見表2。

表2 牛蒡復合保健茶飲料調配正交試驗因素水平表Table 2 Orthogonal test factor level table for compound health tea beverage 單位：%

1.2.3 感官品質評價

選擇12 位食品專業人員組成評價小組，對牛蒡復合保健茶飲料的色澤、風味、口感、組織狀態進行評分，根據得分計算復合保健茶飲料的感官綜合評分，滿分為100 分，評分標準見表3[16-17]。

表3 牛蒡復合保健茶飲料感官評分標準Table 3 Sensory evaluation standard of burdock compound healthtea beverage

1.2.4 理化及微生物檢測

多糖：采用苯酚-硫酸法[18]測定；茶多酚：參照GB/T 8313—2018[19]規定的方法測定；總酸度：采用酸堿滴定法[20]測定；可溶性固形物含量：采用折光法[21]測定；鉛：參照GB 5009.12—2017[22]規定的方法測定；砷：參照GB 5009.11—2014[23]規定的方法測定。

菌落總數：參照GB 4789.2—2016[24]規定的方法測定；大腸菌群：參照GB 4789.3—2016[25]規定的方法測定。

1.2.5 數據處理

采用Excel 2017 作圖和分析數據，數據采用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 牛蒡多糖提取工藝優化

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 酶解時間

由圖2 可知，隨著酶解時間的增加，牛蒡多糖得率先上升后下降，120 min 時多糖得率達到最高，為23.67%，之后呈下降趨勢，可能隨著時間延長，多糖部分降解[26]。因此最適酶解時間為120 min。

圖2 酶解時間對牛蒡多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the yield of burdock polysaccharide

2.1.1.2 纖維素酶添加量

由圖3 可知，隨著纖維素酶添加量的增加，牛蒡多糖得率開始時呈上升趨勢，纖維素酶添加量為3.0%時牛蒡多糖得率達到最高值（23.96%），之后下降。因為在一定范圍內，隨著酶添加量的增加，酶與底物接觸幾率增加，有利于酶促反應的進行，酶與底物濃度合適時，有利于多糖的釋放，當酶濃度過高，底物濃度不足，酶解效果反而降低[27]。因此纖維素酶最適添加量為3.0%。

圖3 酶添加量對牛蒡多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on the yield of burdock polysaccharide

2.1.1.3 酶解溫度

由圖4 可知，隨著酶解溫度的升高，牛蒡多糖得率先上升后下降，溫度為50 ℃時多糖得率最高，為24.12%，之后下降。溫度升高，分子運動加快，使溶質快速溶出，多糖得率提高，但過高的溫度，會導致酶分子空間結構發生改變，酶活性降低，影響酶促反應的進行，引起多糖得率下降[28]。因此最適酶解溫度為50 ℃。

圖4 酶解溫度對牛蒡多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the yield of burdock polysaccharide

2.1.2 正交試驗

由表4 可知，各因素對牛蒡多糖得率影響的主次順序為A＞B＞C，即酶解時間＞酶添加量＞酶解溫度，最佳工藝為A2B2C2，即酶解時間120 min，酶添加量3.0%，酶解溫度50 ℃。在此條件下，進行3 次驗證試驗，結果取其平均值，牛蒡多糖得率為24.68%，牛蒡多糖提取液濃度為10 mg/mL。

表4 牛蒡多糖提取正交試驗結果Table 4 Results of orthogonal test for extraction of burdock polysaccharide

2.2 牛蒡復合保健茶飲料配方優化

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 牛蒡多糖提取液添加量

由圖5 可知，隨著牛蒡多糖提取液添加量的增加，牛蒡復合保健茶飲料的感官評分開始時上升，添加量為12%時，分值達最高，為85 分，添加量大于12%時，茶飲料顏色變深，牛蒡氣味過濃，口感下降，感官評分也隨之下降。因此牛蒡提取液最適添加量為12%。

圖5 牛蒡多糖提取液添加量對感官評分的影響Fig.5 Effect of burdock polysaccharide extract addition on sensory score

2.2.1.2 玫瑰花汁添加量

由圖6 可知，隨著玫瑰花汁添加量的增加，感官評分先升高后降低，添加量為20%時，分值達到最高，為93 分，飲料整體口感協調，色澤清亮透明，香氣宜人，添加量大于20%，玫瑰花汁過量，苦澀味呈現出來，感官評分下降。因此玫瑰花汁最適添加量為20%。

圖6 玫瑰花汁添加量對感官評分的影響Fig.6 Effect of rose juice addition on sensory score

2.2.1.3 紅茶汁添加量

由圖7 可知，隨著紅茶汁添加量的增加，感官評分先上升后下降，添加量為14%時，感官評分最高，為91 分，茶飲料口感細膩，風味協調，口感純正，添加量大于14%，紅茶汁過量，茶飲料顏色變深，口感下降。因此紅茶汁最適添加量為14%。

圖7 紅茶汁添加量對感官評分的影響Fig.7 Effect of black tea juice addition on sensory score

2.2.1.4 檸檬酸添加量

由圖8 可知，檸檬酸添加量為0.10%時，感官評分最高，為92 分，茶飲料的糖酸比適宜，酸甜可口，口感柔和，有牛蒡、玫瑰花和紅茶的自然香味，添加量大于0.10%時，酸味較重，影響口感。因此檸檬酸最適添加量為0.10%。

圖8 檸檬酸添加量對感官評分的影響Fig.8 Effect of citric acid addition on sensory score

2.2.2 正交試驗

由表5 可知，各因素對牛蒡復合保健茶飲料感官評分影響的主次順序為：D＞A＞B＞C，即檸檬酸＞牛蒡多糖提取液＞玫瑰花汁＞紅茶汁。保健茶飲料的最佳配方為A2B3C1D2，即牛蒡多糖提取液12%、玫瑰花汁25%、紅茶汁10%、檸檬酸0.10%，添加甜味劑白砂糖6%和蜂蜜0.5%、穩定劑β-環狀糊精0.25%和黃原膠0.1%，經均質、灌裝、封口、殺菌，冷卻，制成保健茶飲料產品，感官綜合評分94 分。該茶飲料整體均勻，色淡黃，清亮透明，酸甜適宜，風味協調，兼具有牛蒡、玫瑰花茶和紅茶的香氣和滋味，營養豐富。

表5 牛蒡復合保健茶飲料調配的正交試驗結果Table 5 Orthogonal test results of burdock compamd health tea beverage blending

2.3 牛蒡復合保健茶飲料的理化與微生物檢測

經檢驗，最佳工藝下制備的牛蒡復合保健茶飲料中，牛蒡多糖含量1.68 mg/mL，茶多酚含量560.60 mg/kg，總酸含量7.22 g/L，可溶性固形物含量8.65%；鉛含量0.092 mg/L，砷含量0.062 mg/L，鉛和砷含量符合國家食品生產標準。菌落總數為2.60×103CFU/mL，未檢出大腸桿菌，符合國家食品生產衛生標準。

3 結論

通過單因素和正交試驗優化牛蒡多糖提取工藝條件，最佳提取條件為：酶解時間120 min，酶添加量3.0%，酶解溫度50 ℃，該條件下牛蒡多糖得率為24.68%。以牛蒡多糖提取液為基礎，與玫瑰花汁、紅茶汁、檸檬酸等進行調配，優化保健茶飲料的配方，得到最佳配方為：牛蒡多糖提取液12%、玫瑰花汁25%、紅茶汁10%、檸檬酸0.10%，甜味劑為白砂糖6%和蜂蜜0.50%，穩定劑為β-環狀糊精0.25%和黃原膠0.10%，按此配方制成的牛蒡復合保健茶飲料口感良好，風味獨特，營養功效齊全，感官綜合評分94 分，理化與微生物檢測指標符合國家食品生產相關標準，具有良好的市場開發前景。