燈盞細辛多酚純化工藝的響應面法優化及其抑菌活性研究

牛鶴麗

（白城醫學高等專科學校，吉林 白城 137000）

多酚是一類含有羥基和苯環的弱極性化合物，包括類黃酮、酚酸、單寧、二苯乙烯等，對人體的健康與營養平衡具有重要影響[1-2]，國內外對其進行大量研究，發現植物多酚具有較好的抗氧化、抗炎及抑菌功效[3-5]。

燈盞細辛(Erigeron breviscapus)屬于菊科多年生草本植物，富含黃酮類、多酚類、咖啡酸酯類等活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂及增強機體免疫等活性[6-7]。目前國內外對于燈盞細辛的研究主要集中在其有效成分提取和相關生物學活性評價等方面，如：Yang 等[8]從燈盞細辛分離出的葡萄糖基轉移酶可高效合成相應酰基-葡萄糖酯或糖苷；朱靜靜等[9]采用超聲輔助提取燈盞細辛中多酚化合物，并體外評價其抗氧化活性；Zhu 等[10]發現黃芩素可抑制NLRP3 炎性體介導的炎癥反應。多酚作為燈盞細辛的主要活性成分之一，其抑菌活性研究目前鮮有提及，而其提取物中仍含有鞣質等雜質[9]，可能影響其活性功效。為此，本研究利用大孔樹脂具有機械篩分與化學吸附的特點，純化燈盞細辛多酚提取物，探討不同工藝條件對產物中多酚化合物回收率的影響，同時考察純化后的多酚化合物對不同受試菌的抑菌活性，從而為燈盞細辛的后續開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

燈盞細辛采購于白城市吉林大藥房，經白城醫學高等專科學校劉大偉老師鑒定為菊科多年生草本植物燈盞細辛。

沒食子酸標準品，成都埃法生物科技有限公司；無水碳酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司；福林酚試劑，上海康朗生物科技有限公司；AB-8、DM 130 型大孔樹脂，天津浩聚樹脂科技有限公司；H103、X-5 型大孔樹脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；HPD-600、NKA-II 大孔樹脂，天津西金納環保材料科技有限公司；瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏，北京奧博星生物技術有限公司；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌，吉林北方微生物研究所；滅菌注射用水，華潤雙鶴藥業股份有限公司；牛肉膏蛋白胨固體培養基，自制；青霉素鈉，山東魯抗醫藥股份有限公司；試驗用水為超純水。

1.1.2 儀器與設備

TU-19 型紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；ME204 型電子天平，梅特勒-特利多公司；RE-52AA 型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；TG18G-II 型臺式高速離心機，鹽城凱特實驗儀器有限公司；COS-211B 型恒溫振蕩器，上海利聞科學儀器有限公司；FC-10AE 型冷凍干燥機，河北國輝實驗儀器有限公司；JC-150-SE 型恒溫恒濕培養箱，青島精誠儀器儀表有限公司；數控超聲波器，上海坤誠科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備

燈盞細辛完全粉碎后，過80 目篩，準確稱取10.00 g 燈盞細辛粉末，加入體積為300 mL 的1%鹽酸-乙醇混合溶液(體積比為2∶98)，于200 W、50 ℃提取50 min 后離心，吸取上清液于35 ℃下濃縮，冷凍干燥（冷阱溫度：-45 ℃，真空度0.020 kPa）后，即得多酚提取物[9]，純化時以水為溶劑，配制成不同濃度的上樣液。

1.2.2 多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteau 法[11]測定不同樣品的多酚含量，具體操作如下：采用體積分數為70%乙醇溶解樣品后，移取1 mL 加入2.5 mL 福林酚試劑，充分振搖后，加入7 mL 飽和碳酸鈉溶液后，以試劑空白作參比，于765 nm 測定吸光度值。配制不同濃度的沒食子酸標準溶液，繪制標準曲線回歸方程為：y=4.212x+0.021（r=0.999 5），表明在0.05～0.2 mg/mL 的多酚濃度范圍下線性關系良好。另將純化后的洗脫液減壓蒸發，濃縮干燥后稱重，根據下式計算純化產物的多酚純度。

1.2.3 不同樹脂的靜態吸附-洗脫性能比較

準確稱取2.0 g 經預處理后的不同型號樹脂[12]，置于50 mL 2.0 mg/mL 多酚提取液中，于30 ℃振蕩吸附24 h 至樹脂飽和吸附后過濾，過濾后的樹脂經純化水清洗后置于錐形瓶內，加入100 mL 體積分數為70%的乙醇，于30 ℃振蕩解吸24 h，測定上清液中多酚含量，根據下式測得不同型號樹脂對多酚化合物的吸附率、洗脫率及回收率[13-14]。

式中：ce為飽和吸附后濾液中多酚的質量濃度，mg/mL；c0為提取液中多酚的質量濃度，mg/mL；cd為洗脫液中多酚的質量濃度，mg/mL；V0為提取液體積，mL；Vd為洗脫液體積，mL；Qe為飽和吸附率，%；Dd為洗脫率，%；R 為回收率，%。

1.2.4 動態吸附-解吸條件優化

1.2.4.1 動態吸附條件考察

以吸附率為考察指標，采用濕法將20 mL 活化的H103 型樹脂裝入層析柱（徑高比為1∶5）內，分別研究不同上樣液質量濃度、上樣液pH 及上樣流速對吸附率的影響，具體如下：①當上樣液pH 為5.0、體積為80 mL，上樣流速為2 mL/min 時，上樣液質量濃度分別為：1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL；②當上樣液質量濃度為2.0 mg/mL，上樣流速為2 mL/min，上樣液體積為80 mL 時，上樣液pH 分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；③當上樣液質量濃度為2.0 mg/mL，上樣液pH 為5.0 時，繪制上樣流速分別為1、2、3 mL/min 的樹脂泄漏曲線。

1.2.4.2 動態洗脫條件考察

以洗脫率為考察指標，分別研究不同洗脫液乙醇的體積分數及洗脫流速的影響，具體如下：①當洗脫流速為1 mL/min，乙醇體積分數分別為：50%、60%、70%、80%、90%；②當乙醇體積分數為70%時，繪制洗脫流速分別為1、2、3 mL/min 的洗脫曲線。

1.2.5 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，固定上樣液體積80 mL、上樣流速2 mL/min、洗脫流速1 mL/min、洗脫液體積120 mL，以上樣液質量濃度（A）、上樣液pH（B）和乙醇體積分數（C）為響應因素，回收率為響應值（Y），設計響應面試驗，確定最佳純化工藝條件，試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.6 抑菌活性試驗

1.2.6.1 菌種活化與樣品配制

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌接種于培養基上，于37 ℃培養24 h 后，制得105CFU/mL菌懸液，吸取20 mL 涂布于平板中，晾干[15]。將純化后的燈盞細辛多酚使用無菌水溶解后，配制成10.0 mg/mL多酚溶液，同時配制10.0 mg/mL 青霉素鈉溶液作為陽性對照[16]。

1.2.6.2 抑菌活性測定

采用濾紙片法考察純化后的燈盞細辛多酚的抑菌活性[17]，具體如下：將直徑6 mm 的滅菌圓紙片分別浸泡于相同濃度的多酚與青霉素鈉溶液中2 h 后，貼于布滿菌液的培養基平板中，于37 ℃培養24 h，檢測抑菌圈直徑，每個受試菌平行檢測3 次，另以無菌水作陰性對照。

1.2.7 數據處理

每組試驗平行測定3 次，試驗結果采用平均值±標準差表示，并采用SPSS 19.0 進行方差分析，檢驗水準α=0.05，當P＜0.05 表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂選擇

由于不同類型大孔樹脂的表面性質、多孔結構及形成氫鍵的能力不同，因而對目標化合物具有不同的吸附能力，分別考察6 種型號樹脂對燈盞細辛多酚的吸附性能，結果見表2。從表2 可知，H103 樹脂的吸附率最高，達到85.7%，且靜態吸附-解吸后，目標化合物的回收率最高，達到71.2%，這歸因于所有樹脂的粒徑相近，而該樹脂的比表面積較大，因此對多酚化合物的吸附量較多，同時其結構中未有功能性基團，且孔表面疏水性較強，因而與多酚中芳烴疏水結構之間的作用力較弱，易于洗脫[18]，因此確定采用H103 樹脂作為吸附劑，進一步研究其對燈盞細辛多酚的分離純化效果。

表2 大孔吸附樹脂靜態吸附性能Table 2 Static adsorption properties of macroporous resins

2.2 動態吸附試驗結果

2.2.1 上樣液質量濃度對吸附率的影響

上樣液質量濃度對燈盞細辛多酚吸附率的影響見圖1。從圖1 可知，當上樣液質量濃度為1.0～2.0 mg/mL時，吸附率無顯著性差異，但隨著上樣液質量濃度增大至2.0 mg/mL 后，吸附率開始下降。這可能歸因于上樣液質量濃度過大，容易造成樹脂被部分雜質堵塞，使得吸附率降低[19]，但當上樣液質量濃度低于2.0 mg/mL 時，樹脂的使用效率較低。因此以上樣液質量濃度1.5、2.0、2.5 mg/mL 作為后續響應面試驗因素考察水平。

2) 啟動聯鎖。當主機停機、主機控制模塊采集到任一啟動聯鎖故障信號時發生啟動聯鎖，主機不允許啟動并發出啟動聯鎖報警，當且僅當故障排除或通過復位清除故障報警時才可啟動主機。

圖1 上樣液質量濃度對吸附率的影響Fig.1 Effects of sample concentrations on adsorption rates

2.2.2 上樣液pH 對吸附率的影響

上樣液pH 對燈盞細辛多酚吸附率的影響見圖2。從圖2 可知，隨著上樣液pH 的增大，吸附率呈先增大后減小的趨勢，當上樣液pH 為5.0 時，吸附率達到最大，這是由于隨著上樣液pH 的變化，目標化合物在溶液中的存在形式發生改變，進而影響其與樹脂的分子間作用。燈盞細辛多酚存在大量的酚羥基，呈弱酸性，在弱酸性溶液中易以分子形式存在，從而有利于樹脂的吸附[20]。因此以上樣液pH 4.0、5.0、6.0 作為響應面試驗因素考察水平。

圖2 上樣液pH 對吸附率的影響Fig.2 Effects of pH values of sample solution on adsorption rates

2.2.3 不同流速的樹脂泄漏曲線

當流出液中目標化合物的濃度約為上樣液多酚質量濃度的1/10 時，則被認為達到泄漏點[21]，此時吸附過程最佳，為此分別考察不同流速下樹脂動態吸附的泄漏曲線，結果見圖3。隨著上樣流速的增大，樹脂的泄漏點對應的上樣液體積逐漸提前，這歸因于多酚化合物在樹脂內的吸附依賴于擴散，若流速過快，其與樹脂表面接觸不充分，因而未有效擴散吸附，便被沖出柱外，但流速過慢又導致吸附時間過長。綜合考慮吸附效率，確定最佳上樣流速為2 mL/min，上樣體積為80 mL。

圖3 不同上樣流速的樹脂泄漏曲線Fig.3 The leakage curves of H103 resin in different flow velocities

2.3 動態洗脫試驗結果

2.3.1 乙醇體積分數對洗脫率的影響

圖4 為不同體積分數的乙醇溶液對燈盞細辛多酚洗脫率的影響。隨著乙醇體積分數的增大，洗脫率逐漸升高，隨后緩慢下降。這歸因于不同體積分數的乙醇溶液極性不同，當體積分數過高時，部分醇溶性雜質易從樹脂解吸脫附，而體積分數過低時，吸附在樹脂內的多酚又較難溶出。因此以乙醇體積分數60%、70%、80%作為響應面試驗因素考察水平。

圖4 乙醇體積分數對洗脫率的影響Fig.4 The effects of eluent concentrations on desorption rates

2.3.2 不同流速的洗脫曲線

圖5 為不同洗脫流速時飽和吸附后樹脂的洗脫曲線。從圖5 可知，洗脫流速越快，洗脫曲線峰形越寬、拖尾越明顯，且乙醇消耗量增多，而采用體積分數為70%乙醇溶液以1 mL/min 流速洗脫時，洗脫曲線的峰型集中、對稱且無明顯拖尾，洗脫效果較好。因此確定最佳洗脫流速為1.0 mL/min，洗脫液用量120 mL。

圖5 不同流速的洗脫曲線Fig.5 The dynamic desorption curves in different flow velocities

2.4 響應面試驗結果及分析

2.4.1 響應面試驗結果

根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken 中心組合設計原理，進行三因素三水平的RSM 分析試驗，分別考察上樣液質量濃度（A）、上樣液pH（B）和乙醇體積分數（C）對多酚化合物回收率（Y）的影響，結果見表3。

表3 響應面試驗結果Table 3 Results of the response surface experiment

2.4.2 響應面方差分析

采用多元回歸擬合上述試驗結果，得到回收率對各因素的二次多元回歸方程：Y=66.94-0.075A+0.013B-0.11C-0.45AB-0.20AC-0.37BC-3.21A2-2.28B2-1.23C2，對其進行顯著性檢驗與方差分析，結果見表4。

表4 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析結果Table 4 The results of significance testing and variance analysis of regression equation

從表4 可知，該回歸模型P=0.000 2＜0.01，表明試驗選擇的二次多項模型回歸效果顯著，可反映實際結果，R2=0.969 0 表明模型可充分擬合試驗數據，同時失擬項P=0.592 1＞0.05 表明該回歸方程擬合度較高，誤差對試驗結果影響較小。在所有作用因素中，僅二次項A2、B2、C2對多酚的回收率影響極顯著（P＜0.01）。從表中F 值可知，各因素的影響順序為：乙醇體積分數（C）＞上樣液質量濃度（A）＞上樣液pH（B）。

2.4.3 兩因素間的交互作用

圖6 為各因素的交互作用對多酚化合物回收率的影響，響應曲面越陡峭，表明該因素對回收率的影響越大[22]，而響應曲面越平滑，則交互作用對回收率的影響不顯著。從圖6 可知，各因素的交互作用均不顯著，曲面較平滑，隨著上樣液質量濃度、上樣液pH和乙醇體積分數的增大，回收率逐漸升高，并出現極大值，隨后呈不同斜率的下降。

圖6 各因素之間的交互作用對回收率影響的響應曲面圖Fig.6 Response surface diagrams showing the interaction effects of various factors

2.5 驗證試驗

通過對二次拋物線函數模型進行極值分析，確定H103 樹脂純化燈盞細辛多酚的最佳工藝條件為：體積為80 mL，質量濃度為1.9 mg/mL，pH 為5.1 的燈盞細辛多酚提取液以2 mL/min 流速上樣后，經體積分數為69%乙醇溶液，以1 mL/min 流速洗脫，對燈盞細辛多酚的理論回收率為67.9%，實際回收率為68.5%，與模型預測值較接近，表明該二次多項回歸模型可預測各因素與響應值間的影響關系。劉祖望等[23]曾采用AB-8 型大孔樹脂純化刺梨多酚，產物純度約為純化前的4.9 倍。張卉等[24]采用XAD-7 型大孔樹脂純化黑果腺肋花楸多酚，產物純度約為純化前的7.8 倍。在本試驗工藝條件下，產物中多酚的純度由11.25%提高至54.76%，約為純化前的4.9 倍，表明該工藝分離純化效果較高，適于燈盞細辛多酚提取物的純化。

2.6 純化后的燈盞細辛多酚抑菌活性

純化后的燈盞細辛多酚對不同細菌的抑菌效果見表5。該多酚化合物對3 種細菌均有一定的抑制作用，其中抑制金黃色葡萄球菌的生長最為明顯，抑菌圈直徑達到（14.19±1.14）mm，這與李柯欣[25]研究茶多酚對不同受試菌的抑制作用結果一致，而陽性對照采用的青霉素鈉則對3 種細菌均有較強的抑制作用，特別是對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達到（15.79±1.33）mm。兩種物質對大腸桿菌的抑制有極顯著性差異（P＜0.01），而對枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制有顯著性差異（P＜0.05）。

表5 不同樣品的抑菌圈直徑(n=3)Table 5 Inhibition zone diameters of different materials(n=3)單位：mm

3 結論

隨著對天然產物生物活性研究的不斷深入，大量多糖類、黃酮類、皂苷類等化合物被發現抑菌活性較好，為此本研究探討了大孔樹脂純化燈盞細辛多酚的最佳工藝條件并分析其抑菌活性。結果表明，體積為80 mL，質量濃度為1.9 mg/mL，pH 為5.1 的燈盞細辛多酚提取液以2 mL/min 流速上樣后，經體積分數為69%乙醇溶液，以1 mL/min 流速洗脫，對燈盞細辛多酚的理論回收率為67.9%，實際回收率為68.5%。抑菌活性試驗顯示，純化后的燈盞細辛多酚對大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，特別是對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，因此可為相關天然產物的后續開發與利用提供參考依據。