益智總黃酮超聲輔助提取工藝的響應面法優化及其抗氧化活性評價

李生茂，李倩茹，張馨予，林雪晶，雷 蕾，周春陽

（川北醫學院藥學院，四川 南充 637100）

益智為姜科山姜屬植物益智（Alpinia oxyphylla Miq.）的干燥成熟果實，為傳統藥食同源中藥，是海南產道地藥材，也是“四大南藥”之一，具有暖腎固精縮尿，溫脾止瀉攝唾的功效[1]。除藥用外，益智在食品、保健品等領域也應用廣泛。早在晉代《南方草木狀》中就有關于“……嘗以益智粽餉魏武帝”的記載[2]。海南部分地區也有將益智鮮果腌漬后食用的習俗，具有治脹氣及腹痛、助消化的作用。近年來，以益智為主料還制成果脯、酒、蜜餞、糖及茶等多種食品或保健品，具有較高的開發價值[3-4]。

現代研究發現，黃酮類成分是益智重要的活性物質之一，具有抗氧化、抗炎、神經保護和抑菌等多種藥理活性[5-7]。目前，關于益智總黃酮提取工藝優化及抗氧化活性的研究較少，且未見有總黃酮與抗氧化活性相關性的研究報道。為了更好地開發利用益智藥材資源，本文以益智總黃酮提取率為指標，在單因素試驗考察甲醇濃度、超聲時間及液料比對益智總黃酮提取率影響的基礎上，采用響應面（Box-Behnken）試驗設計優化了其超聲輔助提取工藝，采用DPPH、ABTS 和FRAP 法評價了其體外抗氧化活性，并探討了益智總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH），由美國Sigma 公司生產；2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）、過硫酸鉀，由上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產；蘆丁，由四川省維克奇生物科技有限公司生產；維生素C，由廣東光華科技股份有限公司生產；甲醇（分析純），由成都市科龍化工試劑廠生產；水為超純水，實驗室自制；益智，經川北醫學院藥學院李毅主任中藥師鑒定為姜科植物益智（Alpinia oxyphylla Miq.）的干燥成熟果實，樣品S1、S2、S5、S6、S7、S8、S9、S10 的產地為海南，樣品S3 的產地為云南，樣品S4 的產地為廣東。

1.1.2 儀器與設備

Muitiskan Go 全波長酶標儀，Mettle AE 240 十萬分之一電子天平，KQ-300DE 型超聲清洗器，N4 紫外分光光度計，TGL-18 臺式高速冷凍離心機。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁適量，加甲醇配制成濃度為1 mg/mL的蘆丁對照品溶液，備用。分別精密吸取蘆丁對照品溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL 至10 mL 具塞比色管中，再依次加入4 mL 1%AlCl3溶液，2 mL pH 為5.4 的醋酸-醋酸鈉緩沖液，并加甲醇至10 mL，搖勻，40 ℃水浴靜置20 min，于410 nm 處測定吸光度值[8]。以蘆丁對照品溶液濃度C（mg/mL）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：A=25.102C-0.011 2（R2=0.999 2），蘆丁在0.005～0.03 mg/mL 范圍內線性關系良好。

1.2.2 益智總黃酮的提取

取各益智樣品粗粉（過2 號篩），每份約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入一定體積的不同濃度甲醇，稱定質量，設定超聲功率100 W，超聲提取，放冷至室溫，再稱定質量，并用相應溶劑補足減失的質量，搖勻，于7 000 r/min 離心10 min，取上清液，備用。

1.2.3 益智總黃酮提取率的測定

精密吸取益智樣品溶液0.5 mL 于10 mL 具塞比色管中，按“1.2.1”中的方法測定，根據標準曲線計算樣品溶液中總黃酮濃度，并按以下公式計算總黃酮提取率。

w（%）=（c×V×n）/m×100

式中：w 表示總黃酮提取率（%）；c 表示提取液中總黃酮濃度（mg/mL）；V 表示提取液體積（mL）；n 表示稀釋倍數；m 表示益智樣品取樣量（mg）。

1.2.4 單因素試驗設計

1.2.4.1 甲醇濃度對益智總黃酮提取率的影響

以液料比20∶1（mL/g），采用不同濃度的甲醇（60%、70%、80%、90%和100%）對益智S10 樣品超聲提取60 min（超聲功率100 W），考察不同濃度甲醇對益智總黃酮提取率的影響。

1.2.4.2 超聲時間對益智總黃酮提取率的影響

固定液料比20∶1（mL/g），采用100%濃度的甲醇對益智S10 樣品分別超聲提取10、20、30、40、50、60 min（超聲功率100 W），考察不同超聲時間對益智總黃酮提取率的影響。

1.2.4.3 液料比對益智總黃酮提取率的影響

分別以液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），采用100%濃度的甲醇對益智S10 樣品超聲提取60 min（超聲功率100 W），考察不同液料比對益智總黃酮提取率的影響。

1.2.5 響應面法優化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以總黃酮提取率為考察指標（Y），甲醇濃度、超聲時間、液料比為自變量（X），采用響應面設計方法進行三因素三水平的試驗，對益智總黃酮的超聲輔助提取工藝條件進行優化，試驗因素水平見表1。

1.2.6 益智樣品總黃酮含量的測定

精密稱取益智樣品（S1～S10）粗粉，約1 g，按“1.2.5”中確定的最佳提取工藝條件制備樣品溶液，精密吸取0.5 mL 至10 mL 具塞比色管中，按“1.2.3”中的方法測定并計算總黃酮含量。

式中：c 為提取液中總黃酮濃度（mg/mL）；V 為提取液體積（mL）；m 為益智樣品取樣量（g）。

1.2.7 益智抗氧化活性的測定

1.2.7.1 DPPH 法測定抗氧化活性

分別取不同濃度供試樣品溶液與230.50 μmol/L DPPH 甲醇溶液各0.15 mL，置于96 孔板中，迅速混勻，40 ℃避光反應60 min，于517 nm 處測定吸光度值，設6 個復孔，按以下公式計算清除率[9]，并以清除率（Y）對樣品濃度（X）進行對數回歸，根據對數函數方程求出清除率為50%時樣品的濃度（IC50），另取陽性對照VC 溶液，同法測得其IC50值。

式中：A0為空白吸光度值（即以甲醇代替樣品）；Ai為樣品吸光度值。

1.2.7.2 ABTS 法測定抗氧化活性

將濃度為6.83mmol/L 的ABTS 溶液與2.46 mmol/L過硫化鉀溶液等體積混合，室溫暗處靜置12 h，再加蒸餾水稀釋，使其在734 nm 處的吸光值在0.70±0.02左右[10]。精密吸取不同濃度的供試品溶液與ABTS 液各0.15 mL，置于96 孔板中，迅速混勻，40 ℃避光反應70 min，于734 nm 處測定吸光度，設6 個復孔，按以下公式計算清除率，并以清除率（Y）對樣品濃度（X）進行對數回歸，根據對數函數方程求出清除率為50%時樣品的濃度（IC50），另取陽性對VC 溶液，同法測得其IC50值。

式中：A0為空白吸光度值（即以甲醇代替樣品）；Ai為樣品吸光度值。

1.2.7.3 FRAP 法測定抗氧化能力

將300 mmol/L 的醋酸緩沖液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶液（用40 mmol/L HCl 配制）、20 mmol/L 的FeCl3溶液按體積比10∶1∶1 的比例混勻，37 ℃保溫30 min，得FRAP 工作液[11]。精密吸取不同濃度的FeSO4·7H2O 溶液5 μL 與TPTZ 工作液150 μL 置于96 孔板中，迅速混勻，30 ℃反應5 min，于593 nm 處測定吸光度值。以FeSO4·7H2O 溶液濃度C（mmol/L）對吸光度值（Y）進行線性回歸，繪制標準曲線為：Y=6.464 9C+0.038 4，R2=0.999 0，FeSO4·7H2O 線性范圍為0.006 3～0.187 5 mmol/L。

取益智樣品溶液5 μL 與TPTZ 工作液150 μL置于96 孔板中，迅速混勻，30 ℃反應5 min，于593 nm處測定吸光度值，樣品的總抗氧化能力以Fe2+的還原當量（mmol/L）表示。另取陽性對照VC 溶液，同法測定其總抗氧化能力。

1.2.8 數據處理

采用Excel 2016 軟件作圖，Design-Expert 7.1.3.1軟件進行響應面試驗設計及分析，SPSS13.0 軟件進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 甲醇濃度對益智總黃酮提取率的影響

如圖1 所示，益智總黃酮提取率隨甲醇濃度的增加而增加，當濃度達到90%時，其提取率增加趨勢相對變緩，100%甲醇時提取率達到最高，這可能與益智中主要的黃酮類化合物多以黃酮類或黃酮醇類苷元（楊芽黃素、伊砂黃素、白楊素、山柰素、Kaempferol-7,4'-dimethyl ether、鼠李檸檬素和生松素）的形式存在有關[7]。

圖1 甲醇濃度對益智總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of methanol contents on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus

2.1.2 超聲時間對益智總黃酮提取率的影響

如圖2 所示，在本試驗條件范圍內，超聲時間對益智總黃酮提取率的影響較小，提取率總體隨著超聲時間的延長有緩慢增加趨勢，在提取30 min 時提取率達到最高，此后隨著超聲時間的繼續延長，總黃酮提取率趨于平穩。說明在黃酮含量一定的情況下，在提取一定時間后，提取液中總黃酮與藥材細胞中總黃酮濃度已達到平衡，再延長超聲時間則浪費時間和能源。

圖2 超聲時間對益智總黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of ultrasound time on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus

2.1.3 液料比對益智總黃酮提取率的影響

如圖3 所示，隨著提取溶劑用量的增加，益智總黃酮提取率逐漸增加，當液料比增加到20∶1（mL/g）時，總黃酮的提取率達到最大值，而后隨液料比的增加，提取率相對穩定，增幅較小。原因可能是液料比達到20∶1（mL/g）時，益智樣品中總黃酮幾乎完全被提取，故增加提取溶劑用量后總黃酮提取率增幅也不顯著。

圖3 液料比對益智總黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of liquid-to-material ratios on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus

2.2 響應面法優化益智總黃酮超聲輔助提取最佳工藝試驗結果

2.2.1 模型的建立與分析

響應面試驗設計方案及結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface

通過Design-Expert 7.1.3.1 軟件對表2 中的試驗數據進行二次多項式回歸擬合，得到總黃酮提取率（Y）對甲醇濃度（A）、超聲時間（B）、液料比（C）的回歸模型方程為：Y=-1.828 95+0.036 152A+1.017 5×10-3B+0.030 63C-4.75×10-5AB-1×10-5AC-1.8×10-4BC-1.342 5×10-4A2+1.257 5×10-4B2-4.87×10-4C2。

響應曲面圖可更加直觀地反映甲醇濃度（A）、超聲時間（B）、液料比（C）3 個因素兩兩交互作用對益智總黃酮提取率的影響（圖4）。響應曲面的陡峭程度與該交互作用的顯著性成正比，曲面越陡峭，說明交互作用越顯著。等高線的橢圓率也可以直觀地反映交互作用的強弱，等高線橢圓率越大，說明該交互作用越顯著[13]。由圖4 可知，AB、BC 及AC 之間交互作用對總黃酮提取率的影響均不顯著。

圖4 各因素間的交互作用對益智總黃酮提取率影響的響應面圖Fig.4 Response surface diagrams showing the effects of interactive items on the extraction rates of total flavonoids of Alpinia oxyphylla fructus

2.2.2 最佳提取工藝條件的確定

通過響應面分析確定益智總黃酮最佳提取工藝條件為：甲醇濃度100%，超聲時間20 min，液料比25∶1（mL/g），該條件下益智總黃酮提取率的理論值為0.766%。在最佳提取工藝條件下進行驗證試驗，益智總黃酮平均提取率為0.757%，該結果與理論值比較接近，相對標準偏差（RSD）為1.65%，表明響應面模型可靠性較高，具有一定的實際應用價值。

2.3 10 個批次益智總黃酮含量比較

如表4 所示，10 個批次益智的總黃酮含量有明顯差異，含量在2.917～7.565 mg/g，最大值是最小值的2.5 倍左右，含量的高低順序依次為：S10＞S5＞S9＞S7＞S2＞S3＞S8＞S6＞S1＞S4，但影響各批次益智總黃酮含量高低的具體原因還有待于進一步研究。

表4 10 個批次益智總黃酮含量Table 4 Total flavonoids contents of AOF 單位：mg/g

2.4 10 個批次益智抗氧化活性測定結果

2.4.1 清除DPPH 自由基能力

DPPH 自由基是一種人工合成的、比較穩定的含氮自由基，常被用來評價物質的體外抗氧化活性。其甲醇或乙醇溶液呈深紫色，在517 nm 處有強吸收。當向DPPH 自由基溶液中加入抗氧化物質時，其N 原子上的孤對電子被配對而褪色，褪色程度與所接受的電子數量成定量關系，因此可以根據溶液褪色的程度來評價樣品的抗氧化能力。即樣品與DPPH 自由基反應后混合溶液顏色越淺，在517 nm 的吸光度越小，樣品清除DPPH 自由基的能力越強[14]。由表5 可知，10個批次益智樣品對DPPH 自由基均有較好的清除能力，IC50值在0.851～3.188 mg/mL（相當于生藥）之間，但均弱于VC。

2.4.2 清除ABTS 自由基能力

ABTS 二銨鹽經過硫酸鉀氧化后生成穩定的藍綠色陽離子自由基，在734 nm 處有強吸收。當體系中有抗氧化物質存在時，ABTS 自由基與之反應，顏色變淡。因此可以根據溶液顏色變化的程度來評價樣品的抗氧化能力[15]。即樣品與ABTS 自由基反應后混合溶液顏色越淡，在734 nm 的吸光度值越小，樣品清除ABTS 自由基的能力越強。由表5 可知，10 個批次益智樣品對ABTS 自由基均有較好的清除能力，IC50值在0.642～1.789 mg/mL（相當于生藥）之間，但均于弱于VC。

表5 10 個批次益智總黃酮清除DPPH 自由基、ABTS 自由基和總抗氧化能力Table 5 Total flavonoids contents,DPPH free radical,ABTS free radical scavenging capacities and total antioxidant capacities of AOF

2.4.3 總抗氧化能力

在酸性條件下，Fe3+-TPTZ 可被樣品中抗氧化物質還原為Fe2+-TPTZ，并呈現出明顯的藍色，在593 nm處有強吸收。當體系中的Fe3+-TPTZ 過量時，檢測Fe2+-TPTZ 的生成量可評價樣品的還原能力，即總抗氧化能力[16]。由表5 可知，10 個批次益智樣品均有較好的總抗氧化能力，其FRAP 值在0.029～0.111 mmol/L之間，但均弱于VC。

2.5 益智總黃酮含量與抗氧化活性相關性分析

為進一步明確益智抗氧化活性與其總黃酮含量之間的關系，采用SPSS13.0 軟件Pearson 相關分析法對益智中總黃酮的含量與抗氧化活性的相關性進行了分析。由表6 結果顯示，益智總黃酮含量與清除DPPH 自由基的IC50值呈顯著負相關（P＜0.05），相關系數為-0.679；總黃酮含量與總抗氧化能力FRAP 值呈顯著正相關（P＜0.05），相關系數為0.761；總黃酮含量與清除ABTS 自由基IC50值也呈負相關，相關系數為-0.431，但相關性不顯著。分析原因，一方面可能是益智中除了富含黃酮類成分外，還存在原兒茶酸、多酚等類抗氧化成分[7,17]，其抗氧化作用的發揮是包括黃酮類成分在內的多類成分共同作用的結果，另一方面也可能是益智黃酮包含有大量黃酮類及黃酮醇類化合物，具有多樣性[7]，其與不同自由基的反應能力及機制有所不同。故益智總黃酮的含量與清除DPPH自由基的IC50值和總抗氧化能力FRAP 值具有顯著的相關性，而與清除ABTS 自由基的IC50值相關性不顯著，但具體原因還有待于進一步研究。

表6 益智總黃酮含量與其抗氧化活性的Pearson 相關分析Table 6 Pearson correlation analysis of total flavonoids contents and antioxidant activities of AOF

3 結論

在單因素考察的基礎上，采用響應面試驗設計對益智總黃酮的超聲輔助提取工藝進行了優化，確定益智總黃酮超聲輔助提取的最佳工藝為：甲醇濃度100%，超聲時間20 min，液料比25∶1（mL/g），在該條件下益智總黃酮的提取率為0.757%，與回歸模型預測值（0.766%），較為接近，說明該模型可靠性較高，對于生產實踐有一定指導意義。抗氧化活性結果表明，益智總黃酮具有較好的體外抗氧化活性，其清除DPPH 自由基、ABTS 自由基的IC50值分別在0.851～3.188 mg/mL（相當于生藥）、0.642～1.789 mg/mL（相當于生藥）之間，總抗氧化能力FRAP 值在0.029～0.111 mmol/L 之間，總黃酮含量與清除DPPH 自由基的IC50值和總抗氧化能力FRAP 值呈顯著相關（P＜0.05），但與清除ABTS 自由基的IC50值相關性不顯著。研究結果為藥食同源中藥益智在食品、保健和醫藥等方面的進一步開發利用提供了一定的試驗基礎。