云南傳統腌制韭菜中一株乳酸菌的分離及發酵特性研究

杜永新，李瓊瑩，尹柯茹，張麗波，郝亞琴，劉雪英，趙世偉，馬萬平，楊子彪

（云南皇氏來思爾乳業有限公司，云南大理 671003）

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）隸屬于原核微生物中的鏈球菌屬，是一種對機體有益的乳酸菌，作為一種工業化發酵劑而被廣泛使用；形態多為球形或者卵球形，直徑一般小于1 μm，成對或者鏈狀生長，其最適生長溫度為38～43 ℃、pH 值6.0～7.0，通常情況下菌體的形態會受到培養基和培養溫度的影響[1]；大多數菌株在50 ℃下能夠生長，在60 ℃下加熱30 min 仍能存活；嗜熱鏈球菌是一種革蘭氏陽性菌，其固有特征為無芽孢、無鞭毛、無運動性，屬于兼性厭氧同型發酵乳酸菌，能夠利用乳糖生成L（+）型乳酸、乙醛和丁二酮，屬于化能異養型微生物；其擁有多種蛋白水解酶，但對乳蛋白水解能力較弱，必須從外界吸收多種小分子營養物質才能較好地實現自身的新陳代謝[2]；嗜熱鏈球菌作為乳品生產過程中非常重要的發酵菌株[3]，具有重大的市場價值[4]，是公認安全的食品級微生物，對人體腸道菌群的平衡、乳糖不耐癥的改善和機體免疫力的調節具有積極作用[5-6]。

云南腌制韭菜產自云南省大理白族自治州賓川縣，由當地自產韭菜、韭花等食材泡制而成，其味道鮮美、酸香味濃郁、色澤鮮艷[7]。腌制韭菜中微生物群落復雜多樣，含有豐富的乳酸菌、酵母菌等，而獨特的產香性能也與其微生物群落中乳酸菌所產雙乙酰等有關。雙乙酰亦稱雙乙酰酮或2,3-丁二酮，是一種重要的食品風味物質[8-9]。雙乙酰是很多發酵乳制品如奶油、酪乳、發酵乳、干酪的主要風味物質，在合適濃度時，其可增加發酵乳制品的香味，同時也是啤酒和葡萄酒等的重要異味來源[10]。

試驗選取產自云南地區的腌制韭菜，利用傳統的微生物分離純化及分子鑒定技術，對其中的產雙乙酰乳酸菌進行分離鑒定，并確定篩選菌株的雙乙酰產量，最終篩選出一株生長性能佳、產雙乙酰、耐受性良好的優勢菌種，旨在為開發風味獨特的工藝化乳酸菌發酵劑和新型功能性食品制備提供理論依據及數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

韭菜腌菜，云南大理特色食品廠提供；MC 培養基、M17 培養基，青島海博生物技術有限公司提供；雙乙酰標準品，Sigma 提供；PCR Mix 酶、細菌16S rDNA 通用引物、ddH2O，生工生物工程（上海）股份有限公司提供；DNA 提取試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司提供；三氯乙酸，江蘇強盛功能化學股份有限公司提供；氫氧化鈉，天津大茂化學試劑廠提供。

1.1.2 試驗儀器

PCR 儀，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司產品；凝膠成像系統，北京科創銳新生物科技有限公司產品；顯微鏡；漩渦振蕩器，濟南歐萊博生物科技有限公司產品；恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品；SW-CJ-1F 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司產品；臥式高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品中疑似乳酸菌的分離與保藏

吸取1 mL 腌制韭菜汁，采用PBS 對其進行10 倍梯度稀釋，選擇合適的濃度梯度，吸取1 mL 涂布于M17 固體平板，置于38 ℃培養箱中培養48 h。培養結束后挑選出平板上性狀不同的單菌落在M17培養基上進行劃線，直至獲得純培養物，然后進行革蘭氏染色和接觸酶試驗。純化菌株經濃縮后轉接于含有10%甘油的M17 液體培養基中冷凍保藏。

1.2.2 菌株的鑒定

（1）形態學觀察。將篩選出的疑似乳酸菌菌株培養液劃線接種到M17 固體培養基上，恒溫38 ℃培養48 h，觀察并記下菌落的特征、形態、大小、表面光滑程度，菌面隆起程度、菌落邊緣的整齊程度等基本特征。將菌株的純培養物進行涂片，然后進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察記錄其細胞形態特征。

（2）菌株總DNA 提取。乳酸菌基因組總DNA由上海生工公司提供的Ezup 柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取；1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測后保存在-20 ℃的冰箱中。

（3）16S rRNA 擴增。16S rRNA 擴增的上、下游引物采用的是細菌通用引物。引物序列及擴增目標長度如下。

細菌通用引物序列及擴增片段長度見表1。

表1 細菌通用引物序列及擴增片段長度

按下表反應體積及反應程序進行PCR 擴增目的基因。

PCR 反應體積及反應程序見表2。

表2 PCR 反應體積及反應程序

按照反應體系加樣后，輕輕混勻并簡短離心，反應結束取5 μL PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并設空白對照。

（4）序列分析。在NCBI 上將GenBank 核酸序列數據庫的已知序列和所得序列進行比較，當相似度在98%以上的，可以被認為是同一種。

1.2.3 菌株性能測定

（1）耐受性測定。將活化好的嗜熱鏈球菌C198-B-03 轉接至pH 值分別為2.5 的M17 培養液中混勻，于恒溫培養箱內38 ℃下靜置培養2 h，培養結束測定活菌數；按公式計算存活率；將活化好的嗜熱鏈球菌C198-B-03 轉接至膽鹽質量分數為0.3%的M17 培養液中混勻，于恒溫培養箱內38 ℃下靜置培養3 h，培養結束測定活菌數。

（2）奶管中發酵性能測定。將活化后的菌種按2%（V/V）的接種量轉接至12%（W/V）脫脂乳管內，于恒溫培養箱內38 ℃下靜置培養，記錄凝乳時間、凝乳時滴定酸度；測定接種后24，48，72，96 h 3 個溫度梯度保藏（4 ℃、室溫、38 ℃）下的活菌數和滴定酸度，活菌數、滴定酸度測定分別參照GB 4789.35—2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗[11]和GB 5009.239-2016 食品安全國家標準 食品酸度的測定[12]所述方法測定。

1.2.4 嗜熱鏈球菌C198-B-03 產雙乙酰含量測定

（1）雙乙酰標準曲線的建立。取一定量的雙乙酞標準品配制成質量濃度分別為0，3.0，6.0，9.0，12.0，15.0 mg/L 的雙乙酞標準溶液。再取12 支試管分兩排放置，分別加入5 mL 上述不同質量濃度的標準溶液各2 支，第一排試管中加入1%的鄰苯二胺溶液0.25 mL，第二排試管作為空白組不加，搖勻后置于黑暗處放置30 min。待反應完全，第一排試管加4.0 mol/L 鹽酸溶液1.0 mL，第二排試管加4.0 mol/L鹽酸溶液1.25 mL，終止反應。混勻后以空白組作為參比液，于波長335 nm 處測定吸光度。以雙乙酞質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

（2）發酵乳樣品中雙乙酰含量的測定。

①取待測發酵乳20 mL，與等體積16%三氯乙酸溶液混勻，靜置10 min，于4 ℃下以轉速3 500 r/min離心10 min；②離心結束，小心吸出上清液，并用濾紙過濾，保證上清液澄清；③吸取步驟（2）制得的溶液各10 mL 于2 只試管內，分別編號為1 和2，向1 號管內加入1%鄰苯二胺溶液0.5 mL，充分混勻，2 號管不加；④將1、2 號管置于暗處避光反應30 min；⑤反應結束后分別向1 號管內加入4 mol/L HCl 溶液1 mL，2 管內加4 mol/L HCl 溶液2.5 mL 混勻終止反應；⑥以2 號管作為參比，利用紫外-可見分光光度計于波長335nm 處測定其OD 值，每個樣品重復3 次試驗；⑦根據雙乙酰標準曲線獲得待測樣品中雙乙酰質量濃度。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 C198-B-03 菌株菌落形態

C198-B-03 菌落生長形態情況見圖1，C198-B-03 菌體鏡檢情況見圖2。

圖1 C198-B-03 菌落生長形態情況

由圖1 可知，C198-3-03 菌落呈圓形、乳白色、不透明，表面有凸起、光滑濕潤，邊緣整齊，菌落直徑大小約為0.1 mm。由圖2 可知，經革蘭氏染色后在光學顯微鏡下C198-B-03 菌株為革蘭氏陽性（G+），菌體形狀呈球形長鏈狀存在，無芽孢、無鞭毛。

圖2 C198-B-03 菌體鏡檢情況

2.1.2 菌株分子生物學鑒定

（1）C198-B-03 菌株16S rRNA 瓊脂糖凝膠電泳結果。將初步獲得革蘭氏陽性（G+）、過氧化氫酶陰性的菌株暫定為乳酸菌，按UNI-Q 柱式細菌DNA抽提試劑盒說明書步驟提取細菌基因組，以細菌16S rRNA 通用引物作為引物，細菌基因組為模板進行PCR 擴增，擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

C198-B-03 PCR 產物凝膠電泳情況見圖3。

圖3 C198-B-03 PCR 產物凝膠電泳情況

由圖3 可知，擴增產物的片段長度為1 500 bp左右，與預期大小一致，圖像清晰、無彌散且無雜帶，表明PCR 擴增產物質量較高，可用于后續的測序。

（2）C198-B-03 菌株16S rRNA 序列分析。將C198-B-03 菌株的16S rRNA PCR 擴增產物送生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果顯示擴增產物序列長度為1 375 bp。將C198-B-03 菌株的16S rRNA 序列與Gen-bank 數據庫中的序列進行同源性比較。

C198-B-03 菌株的同源性比較見表3。

表3 C198-B-03 菌株的同源性比較

結果顯示，C198-B-03 菌株和嗜熱鏈球菌ST64987、嗜熱鏈球菌PNGR K13 等的同源性相似度最高，達100%，可初步判定C198-B-03 菌株為嗜熱鏈球菌。

（3）C198-B-03 菌株系統發育樹。將16S rRNA基因序列在NCBI 上進行BLAST 比對，利用MEGA7.0軟件構建系統發育樹[13]。由C198-B-03 菌株系統發育樹可知，C198-B-03 菌株與Streptococcus thermophilus strain ST64987、Streptococcus thermophilusstrain N4L 等具有較高的親緣關系，結合形態學特征及基因序列分析結果，可將C198-B-03 菌株確定為嗜熱鏈球菌。

菌株C198-B-03 基于16S rRNA 基因的系統發育樹見圖4。

圖4 菌株C198-B-03 基于16S rRNA 基因的系統發育樹

2.2 菌株耐受性分析

嗜熱鏈球菌作為益生菌被人和動物食用時，會遇到胃酸環境的脅迫；作為發酵菌株被用于食品工業時，會遇到加工和貯藏環境的酸脅迫；乳酸菌在培養過程中，會遇到自身產酸造成的脅迫；而益生菌在人體內充分發揮其特定的益生功能最重要的一點需要順利通過胃中酸性環境和十二指腸高膽鹽環境，以活菌狀態到達小腸和大腸，這樣才能發揮益生菌微生態調節的功能，據此在益生菌篩選過程中對酸性環境和膽鹽的耐受是益生菌必備的生理特征。一般來說，人體胃酸pH 值為2～3，小腸中的膽鹽濃度為3～5 mmol/L，通常研究者以pH 值為2.5，膽鹽質量濃度為3 g/L 的培養基介質對菌株進行耐酸耐膽鹽能力篩選[14]。通過將篩選的嗜熱鏈球菌C198-B-03在pH 值為2.5 的M17 液體培養基中作用2 h 后其存活率可達50.98%，經膽鹽質量分數為0.3%的M17作用3 h 后存活率可達44.11%；即說明篩選得到的嗜熱鏈球菌C198-B-03 具有較優的膽鹽耐受性和酸脅迫性，可作為腸道耐受潛在菌株應用，有較大開發價值。

2.3 菌株產雙乙酰能力測定

2.3.1 雙乙酰標準曲線的繪制

雙乙酰標準曲線見圖5。

圖5 雙乙酰標準曲線

由圖5 可知，由圖可知，采用鄰苯二胺比色法測定雙乙酰的標準曲線，其線性關系良好。該標準曲線的回歸方程為Y=0.079 7X+0.007 9，R2=0.999 7。

2.3.2 試樣中雙乙酰濃度測定

采用鄰苯二胺比色法測定試樣OD335值，并參照雙乙酰標準曲線計算試樣中雙乙酰的質量濃度；根據試驗結果測得試樣OD335值為0.783 0，帶入回歸方程計算出試樣中雙乙酰的質量濃度，即嗜熱鏈球菌C198-B-03 在12%脫脂乳中發酵6 h 后其代謝雙乙酰含量可達9.725 2 mg/L。

2.4 發酵特性分析

2.4.1 嗜熱鏈球菌C198-B-03 在M17 中的生長曲線

菌株C198-B-03 在M17 中，溫度38 ℃發酵的生長曲線。

C198-B-03 在M17 中的生長曲線見圖6。

圖6 C198-B-03 在M17 中的生長曲線

結果顯示，該菌在1 h 后開始進入對數期，其對數期保持至4 h；4 h 后進入穩定期，菌液OD 值保持在1.023 并趨于穩定，一直持續至24 h；在M17液體培養基中38℃培養條件下嗜熱鏈球菌C198-B-03 的最大比生長率為0.38。

式中：dX——單位時間OD 值增量；

dT——單位時間。

2.4.2 嗜熱鏈球菌C198-B-03 在奶管中發酵性能及穩定性測定

將活化后的菌株按2%（V/V）接種于滅菌后的脫脂乳管內，于38 ℃下恒溫培養，凝乳后將奶管取出分別置于4 ℃，室溫38 ℃條件下保藏或繼續培養，并于24，48，72，96 h 后測定樣品滴定酸度和活菌數。

嗜熱鏈球菌C198-B-03 發酵奶管在不同條件下滴定酸度變化見圖7，嗜熱鏈球菌C198-B-03 發酵奶管在不同條件下活菌數變化見圖8。

圖7 嗜熱鏈球菌C198-B-03 發酵奶管在不同條件下滴定酸度變化

圖8 嗜熱鏈球菌C198-B-03 發酵奶管在不同條件下活菌數變化

結果表明，嗜熱鏈球菌C198-B-03 單菌株發酵12%脫脂乳時具有很快的產酸速度，發酵3 h 開始凝乳，其凝乳時滴定酸度達48°T，黏度7.098 Pa·s；冷藏條件下儲藏穩定性測定結果顯示，4 ℃條件下96 h 內滴定酸度由60°T 增至86°T，活菌數呈現先上升后下降趨勢，并趨于穩定，其活菌數最高可達5.15×108CFU/mL；室溫條件下儲藏穩定性結果表明，96 h 內滴定酸度由64°T 增至106°T，活菌數隨儲藏時間增加而呈現下降趨勢，室溫下96 h 時活菌數為2.2×108CFU/mL。

在乳酸菌發酵過程中，隨著產酸量的增加，乳酸菌的生長受到抑制。一般情況下，與保加利亞乳桿菌相比，嗜熱鏈球菌的酸穩定性較弱。因此，在酸性發酵乳中的穩定性是限制嗜熱鏈球菌產酸能力的一個重要因素。在試驗中，嗜熱鏈球菌C198-B-03 在38 ℃條件下連續發酵12%脫脂乳96 h 后，極限滴定酸度為120°T，活菌數仍保持在1.5×108CFU/mL，揭示該菌在酸性發酵乳中有較好的穩定性。

3 結論

通過梯度稀釋法從腌制韭菜中分離到一株高產雙乙酰的嗜熱鏈球菌C198-B-03。在12%脫脂乳中發酵6 h 其代謝雙乙酰含量達9.725 2 mg/L；在pH值為2.5 條件下作用2 h 后其存活率為50.98%，在膽鹽質量分數為0.3%條件下作用3 h 后存活率為44.11%；在M17 液體培養基中其最大比生長速率為0.38；在12%脫脂乳中產酸速率快，發酵3 h 開始凝乳，于38 ℃條件下發酵72 h 后酸不再上升，發酵96 h 極限滴定酸度為120°T，活菌數仍保持在1.5×108CFU/mL，有較好穩定性；可作為優良的酸奶劑發酵菌株及腸道耐受備用菌株開發。

4 討論

嗜熱鏈球菌作為干酷、酸奶等發酵乳制品的主要發酵劑，被公認為是僅次于乳酸乳球菌的第二大重要商業化發酵劑供試菌種[15]。酸奶的質量與發酵劑的生長性能、產酸能力、產風味物質能力是直接相關的[16]，用生長速度快、產酸能力強、后酸化低及產風味物質能力強的發酵劑能縮短發酵乳制備周期、提高產品質量并節約成本；雙乙酰作為一種羰基化合物被認為是酸奶中關鍵的風味物質[17-18]，試驗從云南大理傳統腌制韭菜中分離得到一株產酸速率快、后酸化低、高產雙乙酰且對酸和膽鹽耐受性較優良的嗜熱鏈球菌，并在發酵乳中有較好的穩定性，可作為功能性發酵劑進一步開發。