類器官培養在癌癥中的應用及展望

謝雨欣，許峰晟，王 彤，楊春宇，周雪冰，任香善

(延邊大學 1. 醫學院、2. 腫瘤研究中心、3. 國家民委重點實驗室/吉林省科技廳重點實驗室，吉林 延吉 133002)

類器官是由干細胞驅動而以自我組裝的方式構建形成的3D細胞復合體，能夠模擬人體器官的結構和功能[1]。類器官的3D培養是指將分離出的干細胞植入含多種生長因子的基質膠中，在一定體外條件下誘導培養，形成的包含不同組織來源的上皮細胞結構、能夠不斷自我增殖及分化、與目的器官功能相類似的3D細胞復合體。類器官根據來源可分為3種：胚胎干細胞和多能干細胞等衍生的類器官、組織來源干細胞衍生的類器官以及腫瘤患者來源的病變干細胞衍生的類器官。

自2014年Lancaster和Knoblich首次系統地提出類器官的概念[2]以來，類器官技術有了長足的進步。研究者們根據不同組織來源的類器官制定最適合其生長的培養體系，并將其在體外長期培養，保存了其來源患者的組織學特征及基因組特性。目前，類器官模型主要應用于腫瘤發生機制的研究、分子標志物的篩選及各類藥物的毒性檢測、藥效評價、新藥篩選、建立臨床前模型、精準醫療、研究組織器官發育及組織器官的移植和修復等領域(Fig 1)。該文將對類器官模型在腫瘤治療中的研究現狀、應用及前景進行綜述。

1 類器官技術在腫瘤中的研究現狀

從2009年Sato等[3]成功進行腸類器官的長期培養后，類器官的研究開始逐漸發展，但由于缺乏有效的培養體系，其臨床應用受到了極大限制。類器官培養基的成分可分為一般成分和特殊成分。目前，類器官培養基的一般成分[4]主要包括基礎培養基成分、B27(一種可以代替血清的培養基補充劑)、氨基酸類、抗壞血酸等。不同類器官所需特殊成分不盡相同，如Wnt-3A常被加入中樞神經系統的培養基中，R-spondin-1(一種可增強β-catenin依賴型Wnt信號轉導的細胞外蛋白)在乳腺、小腸、肝臟類器官的發育生長過程中起支持作用，表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)則可在腸類器官中發揮重要作用。由于腫瘤組織中存在被異常激活的促增殖信號通路或與該通路相關的生長因子，這些信號通路或生長因子并非培養基的必要成分，它們的存在反而影響腫瘤的生長分化。因此，針對這種特殊腫瘤類器官制定選擇性培養基至關重要[5]。如某些結直腸癌中，Wnt信號通路常被特異激活，在該類培養基中可去除Wnt和R-spondin-1；同樣，對于存在EGF受體通路突變的結直腸癌，可去除EGF。通過建立不同類型的培養基，能夠構建出相應突變類型的癌癥類器官。通過這種方法培養出來的類器官既保留了原腫瘤的組織病理學特征以及基因組穩定性[6]，可用于腫瘤的基礎研究及轉化醫學研究。相比于腸癌類器官，胃癌類器官的研究起步較晚但進展迅速。美國學者利用胃類器官闡明了幽門螺桿菌感染誘發胃癌的機制；日本學者在短時間內建立了67例胃癌生物庫并深度探索了胃癌的形態學、基因組學、功能學及胃癌發生發展的機制；Yan等[7]建立了來自34位患者的原發性胃癌類器官生物庫，經長期培養發現其基因組圖譜仍與體內腫瘤極為相似。而由于肝細胞的多樣性和功能的復雜性，肝臟腫瘤類器官的研究仍不夠充分。2017年，Broutier等[8]將3種不同亞型的原發性肝癌，包括肝細胞癌、膽管癌、混合型肝癌進行類器官培養，去除了R-spondin-1，Noggin和Wnt3a，但補充了地塞米松和Rho激酶抑制劑，成功證明了肝癌類器官能夠保留原始腫瘤的組織學結構及基因組構成。2015年Boj等[9]建立了胰腺腫瘤類器官，發現一些正常的胰腺組織樣本在準備胰島移植時被預先消化，將消化后的材料植入基質凝膠中優化培養條件，以支持人類正常和惡性胰腺組織的繁殖。國內已有學者通過優化培養基方案，構建了正常胰腺組織以及5種胰腺癌亞型(導管腺癌、腺鱗癌、神經內分泌腫瘤、腺泡細胞癌、導管內乳頭狀黏液性腫瘤)的胰腺類器官庫[10]，并證明類器官模型可用于進一步探索新輔助治療失敗患者的治療方案。

Fig 1 Establishment and application of organoid model

乳腺癌的研究目前基于2D細胞模型和動物模型，但物種差異與組織差異限制了乳腺癌的研究。Sachs等[11]已開發出優化的乳腺癌類器官培養條件，在體外培養條件中新增加neuregulin 1蛋白，解決了人源腫瘤異種移植模型培養效果差及無法在體外長期培養的問題。同樣地，Djomehri等[12]也針對培養基提出了優化條件，他們假設支架材料本身可能通過機械約束和/或限制關鍵營養素的供應來限制類器官的生長，因此他們建立了無支架的3D乳腺類器官模型以供研究。實驗證明，無支架的3D乳腺類器官模型具有高度一致性和可重復性的優勢，能夠依靠生物打印標準化3D培養物的分析，不僅可用于研究腫瘤微環境對乳腺癌發生的影響，還可用于使用患者衍生的腫瘤標本的實驗中，以促進大規模藥物篩選和患者類器官生物庫的研究。同樣，卵巢癌也是女性的惡性腫瘤之一。最近，兩個獨立的科研團隊報告成功建立了卵巢癌類器官模型。這些癌癥類器官能顯示出原有病變組織的體細胞突變和擴增/缺失[13]以及親本腫瘤的標志物表達、突變情況等組織學和基因組特征[14]。例如，他們在腫瘤抑制基因CREBBP、FOXO1、PRKAR1A和CHEK2中發現了移碼和非同義突變；在腫瘤和相應的類器官中檢測到卵巢癌相關基因BRAF和NOTCH1的非移碼插入和缺失；粘蛋白16也被發現在類器官中表達，它編碼的癌抗原在正常卵巢表面上皮中無法檢測到，但能在卵巢癌上皮中表達，因此可在晚期卵巢癌隨訪中用作生物標志物。此外，類器官因其與原有組織的高度一致性對化療顯示出腫瘤特異性和敏感性，為卵巢癌藥物篩選和治療提供可靠臨床前工具和研究平臺。

除了上述消化系統、生殖系統來源的類器官之外，其他系統來源的類器官研究也在逐步開展。目前肺癌類器官體外培養的干細胞主要來源于肺癌患者，研究者通過3D培養建立了能夠更廣泛地用于臨床前研究的5種肺癌亞型[15]，包括腺癌、鱗狀細胞癌、腺鱗癌、大細胞癌和小細胞癌的類器官模型[16]。這些模型的建立可預測患者對藥物的反應及肺癌個性化藥物的開發。研究者建立的前列腺癌類器官模型在體外傳代后，與腫瘤具有相同的體細胞突變以及相似的轉錄組。實驗發現[17]，突變的FOXA1能夠抑制雄激素信號傳導并促進腫瘤生長，這一新機制的發現為將來的研究確定了優先方向。Mullenders等[18]調整出不同培養基條件，建立了膀胱癌基底細胞類器官。實驗發現，FGFR3突變的細胞在不添加任何生長因子的培養基中可長時間增殖；同時，成纖維細胞生長因子7/10可促進膀胱癌類器官生長。他們成功培養了超過30個傳代的多個類器官系，為膀胱癌類器官生物庫的建立及治療膀胱癌的藥物篩查提供了可能性。

2 類器官模型在腫瘤研究中的應用

2.1 類器官模型在病理研究中的應用類器官模型可用于特定腫瘤表達的分子標志物篩選、癌癥病人分級分期、預后的推測以及治療方案的制定。Gendoo等[19]建立了患者來源的胰腺導管腺癌異種移植模型和類器官模型，并對其進行全基因組測序，證實了類器官模型可用于分子標志物篩查及患者預后的判定。Saito等[20]也建立了人肝內膽管癌、膽囊癌和Vater壺腹神經內分泌癌類器官，確定SOX2、KLK6和CPB2可作為膽管癌患者的預后生物標志物。針對不同腫瘤所表達的不同分子標志物，分離患者腫瘤細胞進行類器官培養，能夠判斷癌癥病人分級分期且篩選出最適合的治療藥物。同時，類器官模型具有實時觀測并修改治療方案的優勢，針對長期使用某種藥物而產生耐藥性的情況也能實時進行藥物優化。

2.2 藥物篩選、新藥開發和精準治療傳統的腫瘤藥物篩選主要依賴于2D細胞系培養和人源腫瘤異種移植(patient derived tumor xenograft，PDTX)。2D的細胞系培養操作簡便，但來源較為單一，與原有腫瘤表達譜的差異顯著且無法長期培養。PDTX來源多樣化，與原有腫瘤表達譜的差異小且能夠長期培養，但由于建模周期長、費用高、難度大等問題限制了其臨床應用。因此，在亟需更加精確的腫瘤藥物篩選的情況下，類器官技術的出現解決了這一難題。

“精準治療”是類器官模型的一大優勢。腫瘤類器官在很大程度上保持了原有腫瘤的異質性和生物學特性，因此能夠通過體外研究來制定個性化治療方案。Wetering等[21]已經證明了大腸癌生物庫的重要性，該庫能夠根據患者自身的特異性進行藥物篩選，通過患者自身來源的腫瘤類器官培養物，測試各種藥物的敏感性和毒性從而獲得最適合患者的治療方法。Broutie等[8]成功證明肝癌類器官能夠保留原始腫瘤的組織學結構及基因組構成，并通過類器官技術證明了C19ORF48、UBE2S、DTYMK、C1QBP和STMN1是與原發性肝癌預后不良相關的新基因，但仍需要進一步研究證明其作為預后指標的實用性。該實驗進一步增進了對肝癌生物學的了解，并為開發針對該疾病的個性化治療方法提供依據。根據遺傳變化(如EGF受體突變)以及生物標志物(如程序性死亡配體1)的表達，Kim等[15]開發出了肺癌的標準化分子靶向療法。研究發現的潛在靶點、生物標志物或遺傳變化等都有望幫助科研人員開發出新型藥物。已有科研人員通過體外類器官實驗提出新型聯合治療方案，將類器官技術與靶向治療相結合，類器官充當活體生物標志物以預測每個患者的治療反應和耐藥性，從而指導“精準治療”。

2.3 腫瘤發生發展機制的研究類器官的體外培養能夠模擬癌癥的發生過程，因此可用于對癌癥發生機制的研究。李亮等[22]研究發現，體外培養的腸癌類器官多數存在Uhrf2缺失，在含有Uhrf2的腸癌類器官中將Uhrf2敲除，腫瘤干細胞數明顯減少，且腫瘤小鼠生存時間延長。其分子機制為Uhrf2與Wnt信號通路下游的重要轉錄因子T細胞因子4結合，通過抑制T細胞因子4的泛素化降解，最終激活Wnt信號通路下游基因的表達，促進腫瘤的發生發展。因此Uhrf2可視為腫瘤干細胞治療腸腫瘤的一個靶點。國內已有學者[23]成功建立了腹水來源的胃癌類器官，發現胃癌腹水上清可以激活惡性腹水來源的腫瘤類器官和胃癌細胞中的Wnt/β-catenin信號通路，且腹水上清促惡性腹水來源的腫瘤類器官生長與Wnt/β-catenin信號通路激活呈正相關。當Wnt信號存在時，Dishevelled蛋白抑制Axin/APC/GSK-3β復合物使之不能磷酸化降解β-catenin，非磷酸化的β-catenin轉運入核調節靶基因的表達。同時根據STAT3的激活可以增加β-catenin在細胞核中的定位，他們推斷STAT3信號通路可能與Wnt/β-catenin信號通路在促腫瘤細胞生存和轉移過程中起協同作用。通過對膽囊癌類器官的測序結果分析，有學者發現[24]，膽囊癌中高表達的睫狀神經營養因子受體通過抑制MAPK/ERK通路的ERK的磷酸化激活，減少基質金屬蛋白酶1和10的表達，而基質金屬蛋白酶1和10可以促進腫瘤的侵襲轉移，因此睫狀神經營養因子受體可導致膽囊癌轉移受抑制。胰腺腫瘤細胞與胰腺腫瘤相關成纖維細胞的相互作用可以引起腫瘤細胞代謝信號通路的失調，從而促進腫瘤的發生發展[25]。針對胰腺癌類器官的轉錄組學分析顯示[26]，GATA6表達程度與Wnt7B表達程度呈負相關，GATA6可通過影響Wnt7B及其下游信號分子決定胰腺癌類器官對Wnt/R-spondin信號通路的依賴性。

3 類器官模型的優勢與不足

類器官模型的優勢主要在于其前瞻性、精準性以及高效性。首先，使用類器官作為臨床前癌癥模型已經成為可能，研究者可以通過類器官技術建立腸癌等類器官模型，指導相應癌癥發生機制及治療方法的研究。其次，類器官模型能夠指導癌癥的精準治療并推動下一代研究。腫瘤的精準治療依賴于對藥物敏感性的檢測，由于基因突變的普遍性及隨機性，患者對藥物的敏感性因人而異，傳統的藥物篩選系統篩選出的藥物臨床應用價值低且價格昂貴。最后，一種藥物的研發周期一般在12年左右，而類器官模型的應用可以大大節省時間和精力。相比2D細胞培養和PDTX，類器官取材靈活，且能夠極大地節省建模時間，例如，使用PDTX建立小鼠模型需要6-8個月，而類器官模型只需1個月左右。

類器官技術是一項近幾年才發展起來的新興技術，相比于2D細胞培養模型和PDTX模型具有一定優勢，但仍然存在不少問題，主要包括共培養問題、復雜性問題、微環境成分問題以及培養方法問題。第一，腫瘤微環境細胞可與癌細胞共培養但時間有限[27]，如何進行腫瘤微環境與癌細胞的長期共培養成為亟需解決的問題；第二，目前類器官技術難以完全重現機體內部復雜的生理調控過程[27]，如何培養出具有神經系統的形體更大、結構功能更復雜的類器官也是亟待解決的問題；第三，腫瘤微環境的建立依舊不夠完善，由于腫瘤微環境會影響腫瘤的進展和轉移，類器官模型中缺乏微環境成分可能會導致正常上皮細胞轉化失敗，因此各類腫瘤類器官體外培養的微環境成分需要一個統一標準；第四，在類器官培養過程中，還可能因實驗室培養方法不同(例如生長因子的差異)造成類器官的差異，因此還缺少一個確定的實驗室培養方法。

4 總結與展望

類器官模型是當今社會干細胞領域的一項重大突破。對研究者而言，依靠類器官模型可以在體外研究腫瘤發生發展的分子機制，不斷發現并驗證新的腫瘤靶點，從而為新藥開發提供依據，甚至有望在未來通過類器官技術進行藥物優化，解決機體的耐藥性問題。類器官模型有助于癌癥發病的建模以及腫瘤分子表型的確認，以便發現各種器官以及腫瘤譜系的起源腫瘤細胞的生物標志物[28]。對患者而言，癌癥綜合治療模式將成為大勢所趨，每一位患者都將通過自身來源的腫瘤類器官的體外實驗，獲得個體化治療方案。離體生長的人源組織還可以取代器官捐贈的需求，為亟需器官移植的患者提供便利[29]。隨著類器官技術的進一步發展，不僅能夠建立罕見疾病的體內外模型、實現高通量藥物篩選，還能夠實時觀測人類早期的發展過程[29]，甚至可以與實時成像技術、3D打印技術結合，探索出一種治療癌癥的新方法。