小鼠原發性膽汁性膽管炎模型及其在疾病研究中的作用

李 浩，關艷玲，張 雨，劉 倩，魏 偉，馬 旸

(安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，安徽抗炎免疫藥物協同創新中心，安徽 合肥 230032)

原發性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是一種慢性膽汁淤積性肝病，其特征是肝內小膽管的破壞，疾病最終可進展為肝纖維化和潛在的肝硬化。目前，PBC發病原因尚未明確，可能由環境、細菌感染、基因等諸多因素引起。人群中年發病率為 0.9-5.8人/10萬人，92%的患者為女性,目前除部分晚期患者接受肝臟移植外，針對PBC中早期的治療手段有限。目前FDA僅批準了兩種治療藥物——熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)和奧貝膽酸(obeticholic acid，OCA)，但約有40%的患者對UDCA無應答[1]。因此，研究PBC的發病機制、尋找藥物的作用靶點對于開發治療PBC的藥物十分重要。動物模型是闡述人類疾病病因和病理機制、開發治療藥物的重要工具，對于PBC的發病機制的探索以及藥物的研發有著重要意義。本文綜述了近年來國內外報道的PBC動物模型研究進展以及各種模型在疾病研究中的應用，為PBC模型的選擇提供參考。

1 PBC的發病機制

PBC的發病機制十分復雜，受遺傳易感性、環境因素及免疫耐受異常的影響。在遺傳易感性方面,人類白細胞抗原和白介素-12在PBC的發生中起重要作用；環境因素可通過分子模擬打破機體對線粒體抗原的自身耐受, 啟動自身免疫反應；機體的免疫耐受缺失(如T細胞、B細胞的免疫調控失衡)，可導致膽管上皮細胞(biliary epithelia cell，BEC)損傷。

自身抗體在PBC的發病中可能起著關鍵的作用，也是PBC的臨床診斷的重要標準之一。在PBC的發生過程中，巨噬細胞吞噬抗原，提呈給T細胞，T細胞分化成效應T細胞并產生一系列的細胞因子，同時B細胞在效應T細胞的輔助下，增殖分化為漿母細胞，最終分化為漿細胞，產生一系列的抗體，其中包括特異性自身抗體——抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody，AMA)。AMA是PBC的特征性自身抗體,見于95%以上的PBC患者, 且隨著檢測技術的提高, AMA的陽性檢出率也明顯升高,但目前認為其水平高低與疾病嚴重程度關系不大。此外，1/3以上的PBC患者可檢出抗核抗體(antinuclear antibody，ANA), 其中抗gp210、p62、sp100、PML等抗核抗體對診斷AMA陰性的PBC患者具有較高的診斷價值，可能與疾病的預后有關[2]。

T細胞在PBC的發病過程中起著關鍵的作用，自身反應性CD4+T細胞和CD8+T細胞被認為是參與PBC的主要機制之一，此前的研究發現PBC患者受損膽管周圍存在大量致病性CD4+T細胞和CD8+T細胞，并且證實CD4+T細胞和CD8+T細胞是主要的致病因素。其中，PBC患者肝組織炎癥部位中浸潤的淋巴細胞主要是CD8+T細胞，CD8+T細胞是患者膽管破壞的效應細胞[3]，主要通過表達FasL及分泌穿孔素和顆粒酶B引起BEC的凋亡。輔助性T細胞(T helper cell, Th)的活化是自身免疫病的重要致病機理之一，有報道稱，Th 17/調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)比例失衡，在類風濕關節炎等自身免疫病中起著關鍵作用[4]，而PBC患者中Treg數量下降, Th17細胞數量增高, 打破兩者之間的動態平衡, 維持自身免疫應答的穩態遭到破壞,可能是引發PBC病癥的原因。

PBC患者的血清B淋巴細胞活化因子水平相比健康人群及丙型肝炎患者均顯著升高, 并且PBC的肝臟組織亦可見B細胞浸潤。提示B淋巴細胞可能在PBC的發病過程中起重要作用，但其具體的作用機制仍有待進一步研究。研究表明[5]，采用利妥昔單抗(rituximab)耗竭B細胞，可以顯著減少B細胞所產生的AMA，降低血清AMA滴度，同時降低血漿免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)的水平以及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的水平，提示耗竭B細胞可能成為治療PBC的新靶點。

自然殺傷細胞(nature killer cell, NK)和自然殺傷性T細胞(nature killer T cell，NKT)與PBC的發病過程緊密相關。研究發現，肝臟的NK細胞具有不同的表型，在dnTGFβRⅡ(dominant-negative transforming growth factor-β receptor type Ⅱ)小鼠模型中，肝臟的DX5—NK細胞作為CD4+T細胞的負性調節因子，可以通過抑制肝臟的CD4+T細胞反應來抑制肝臟炎癥，但是整體的NK細胞對于適應性免疫的調節是雙向的[6]。NKT細胞是打破免疫耐受的始動者, 分泌多種細胞因子, 激活CD4+T細胞、CD8+T細胞等多種細胞, 誘發PBC。

單核細胞也是PBC患者膽管周圍常見的浸潤細胞，促炎表型的單核細胞在PBC患者的外周血中顯著增多，在PBC中其促炎功能顯著升高，并且與肝臟的損傷程度有關[7]，此外，PBC患者外周血中的單核細胞對外界的刺激更加敏感，在病原相關分子模式刺激下，經介導其分泌的促炎因子增多。

BEC是PBC中免疫破壞的靶細胞，在PBC的發病機制中起著關鍵的作用。在相應刺激下能分泌炎性因子以及趨化因子，可能和PBC的發病過程相關。此外，BEC表達HLA-I、HLA-II和多種共刺激分子，促進T細胞的免疫應答。有報道稱，多種原因造成的BEC自噬通量下降，會使得肝內中、小膽管反復受到免疫系統攻擊，不能通過自噬維持穩態，最終導致肝纖維化和肝硬化[8]，提示，維持細胞的自噬功能，增加其自噬通量，有可能成為治療PBC的新方向。

PBC主要由自身免疫驅動，膽汁酸和腸道菌群同樣參與了疾病的進展。膽汁酸能調節膽管反應和膽汁淤積性損傷，并且膽汁酸會使得肝臟的炎癥持續，并且隨著時間的推移導致纖維化。研究表明，對膽汁酸受體使用激動劑、拮抗劑或補充特定的膽汁酸可以調節膽管細胞的增殖和功能[9]。腸道菌群和細菌移位被認為是粘膜免疫反應和耐受的重要原因，腸道微生物群的移位也被認為可以促進PBC[10]。

總之，PBC的發病受到多種因素的影響，其中，自身免疫耐受失衡和膽汁酸循環障礙是導致PBC發生的直接因素。膽汁酸循環障礙可能會導致膽汁淤積癥，而膽汁淤積將會對BEC產生毒性作用，損傷BEC；而自身免疫耐受失衡可能會導致免疫細胞持久性的攻擊BEC，導致BEC的進一步損傷以及疾病的進一步惡化。

2 PBC小鼠模型

在過去的幾十年中，一系列的PBC模型被相繼報道。這些模型加快了進一步研究PBC的發病機制的速度，極大地促進了PBC治療藥物的研發。本綜述介紹多種PBC小鼠模型，描述了該模型的形成原因、組織病理學變化及利用PBC小鼠模型對疾病發病機制和藥物開發的研究進展。

2.1 手術模型手術制備PBC小鼠模型的方法主要是膽管結扎模型(bile duct ligation, BDL)，通過結扎小鼠的膽總管，造成膽總管阻塞，膽汁淤積，從而引起一系列的炎癥反應，引發肝纖維化和肝硬化。該方法于實驗小鼠腹腔切口，在十二指腸起始端膽總管處進行膽總管結扎。此前的研究表明，對C57BL/6J雌性小鼠膽總管結扎，可導致小鼠肝臟發生炎癥反應，匯管區可見嗜中性粒細胞、肥大細胞以及淋巴細胞浸潤[11]。此外，也有采用大鼠進行膽管結扎并成功引起手術大鼠的膽管阻塞，膽汁淤積，總膽汁酸(total bile acid, TBA)和谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平升高的報道[12]。盡管該模型手術方法成熟、成模率高、實驗成本低、可造成膽總管阻塞、肝內膽汁淤積，但并未涉及引起PBC相關的特異性抗體AMA等因子升高，因此，該模型多用于膽汁淤積性疾病的研究。

2.2 藥物誘導模型

2.2.12-OA-BSA誘導模型 2-辛炔酸偶聯牛血清白蛋白(2-octynoic acid coupled to bovine serum albumin，2-OA-BSA)誘導的小鼠模型，可以很好地模擬人類PBC的疾病特征。在完全弗氏佐劑的存在下，用包含結合分歧桿菌株H37Ra(10 g·L-1)的2-OA-BSA(100 g/25 L)腹膜內接種8-9周齡的C57BL/6J雌性小鼠，隨后每隔2周在不完全弗氏佐劑的存在下，對小鼠進行1次腹膜內接種以加強誘導模型。

2-OA-BSA小鼠模型具有許多和人類PBC類似的血清學和病理學特征。用2-OA-BSA誘導小鼠，第4周時，小鼠血清中的抗丙酮酸脫氫酶復合體E2亞基(E2 subunits of pyruvate dehydrogenase，PDC-E2)IgG和IgM抗體顯著升高，第8周時血清抗PDC-E2的IgG和IgM、IgA抗體均升高。在2OA-BSA免疫4-12周時，血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)以及干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)的水平升高，免疫12周后，小鼠的肝臟CD8+T淋巴細胞的比例增高，CD4+T淋巴細胞的比例降低，肝臟CD4+/CD8+T淋巴細胞的比例倒置，而脾臟中CD8+、CD4+T淋巴細胞比例均降低。匯管區可見大量的淋巴細胞或單核細胞浸潤于受損的膽管周圍，主要是CD4+和CD8+T淋巴細胞，其中CD8+T淋巴細胞占主導地位。此外，還可以觀察到肝實質和匯管區的脂肪減少，上皮樣肉芽腫的形成，肝實質也可見小面積的輕度局灶性壞死，這些都與人類的PBC相似。

該模型小鼠也有許多與不同于人類PBC的血清學和病理學的特征，在2-OA-BSA誘導第24周時，未見肝臟的脂肪變性、嗜酸性粒細胞增多以及膽汁淤積的現象。此外，在該模型小鼠的其他組織器官，包括甲狀腺、唾液腺、肺、腎、小腸和結腸未產生免疫損傷，這與人類PBC患者的肝外器官也出現炎癥反應的特點不相符[13]。

采用2-OA-BSA誘發小鼠發生類PBC疾病的方法，可能對人類PBC的病因學提供了新的證據，即環境因素在人類PBC發病中的重要性。

2.2.2DDC誘導模型 采用0.1%的1,4-二氫-2,4,6-三甲基-3,5-吡啶二甲酸二乙酯(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine，DDC)對2月齡的雄性瑞士白化病小鼠飲食喂養8周，即可制備具有類似人類PBC特征的DDC小鼠模型。小鼠暴露于含有DDC的飲食中，可誘導卟啉積累、膽汁淤積、免疫反應和類似肝卟啉癥和硬化性膽管炎的肝膽損傷，出現類似人類PBC的膽管損傷和肝纖維化，但與人類PBC不同的是該模型小鼠的膽管損傷與肝纖維化是平行發生的。此外，該模型小鼠出現一定的膽汁流量的減少，但是無統計學意義，即未出現類似人類PBC的膽汁淤積癥狀。此外，DDC誘導了TNF-α以及骨橋蛋白的表達，骨橋蛋白的表達也偶見于人類PBC[14]。

雖然，該模型小鼠表現出類似人類PBC的膽管和膽管周圍的病理損傷，但該模型小鼠中未觀察到AMA升高等人類PBC的特異性血清學指標，因此該模型小鼠一般用于觀察外源性因素誘導的膽道疾病和膽汁性肝纖維化。

2.2.3polyI:C誘導模型 肌苷酸聚胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid，poly I:C)，是一種1型干擾素(interferon, IFN)誘導劑，采用腹腔注射poly I:C(5 mg·kg-1)誘導6-8周齡雌性C57BL/6J小鼠，每周注射兩次，共28周，即可制備具有類似人類PBC特征的poly I:C小鼠模型[15]。

在poly I:C注射后小鼠血清IFN-α水平升高，注射后3 h內達到最高，注射后24 h后逐漸下降至無法檢測，除了IFN-α外，poly I:C還誘導了其他的促炎細胞因子，包括IL-12 p70、IL-10、單核細胞趨化蛋白-1以及IFN-γ，其中，IL-6的水平在24 h后仍然較高。Poly I:C誘導4周后，小鼠出現唾液腺炎，胰腺炎以及間質性腎炎。注射8周后，匯管區出現大量炎性細胞浸潤，主要是CD4+以及CD8+T淋巴細胞，其中CD8+T淋巴細胞主要定位于膽管附近，肝臟組織中還檢測到CD11b+巨噬細胞以及CD11c+樹突細胞。此外，該模型小鼠血清ALT以及ALP的水平均升高，在polyI:C誘導第24周時，所有小鼠都表現出一種或兩種自身抗體。

Poly I:C誘導模型雖然在AMA的陽性率以及肝纖維化等方面與人類PBC特征有一定差異，但該模型在研究IFN-α在PBC的病因學中具有重要作用。

2.2.42-OA-BSA聯合polyI:C誘導模型 由于2-OA-BSA模型不具有人類PBC患者的肝臟嗜酸性粒細胞浸潤增多以及肝纖維化等特點，而polyI:C模型存在AMA陽性率過低等問題，將2-OA-BSA與polyI:C聯合應用于C57BL/6J小鼠，制得的聯合模型更好的模擬了人類PBC。選用5-6周齡的雌性C57BL/6J小鼠，在2-OA-BSA首次注射免疫后的3 d注射polyI:C(5 mg·kg-1)，每3 d注射1次，即可制得2-OA-BSA聯合polyI:C小鼠模型。

該模型相較于自然病史和疾病嚴重程度較低的2-OA-BSA模型，表現出了更嚴重的膽管疾病，肝臟CD8+T細胞的浸潤顯著增加，IFN-γ、TNF-α、IL-12p40以及IL-6等多種炎性細胞因子的水平均增加。此外，該模型匯管區和肝實質嗜酸性粒細胞浸潤增多，肝臟纖維化形成的特點更加符合人類PBC的病理特點。

2.3 抗原免疫模型

2.3.1新鞘氨醇桿菌免疫模型 新鞘氨醇桿菌(Novosphingobium aromaticivorans)是一種革蘭陰性菌，通常存在于土壤、水和海岸平原沉積物中,其和PBC患者體內的線粒體自身抗原PDC-E2、側鏈二氧酸脫氫酶復合體E2亞基(2-Oxo acid dehydrogenase，BCOADC-E2)以及2-氧戊二酸脫氫酶復合體E2亞基(2-Oxo-glutarate，OGDC-E2)具有高度的氨基酸同源性，并且與PBC患者體內的PDC-E2表達相同的鞘糖脂CD1，可被NKT細胞識別并激活該細胞，將新鞘氨醇桿菌以5×107cfu靜脈注射C57BL/6J、NOD以及SLJ品系小鼠，兩周后所有品系小鼠均出現膽管損傷、匯管區大量炎性細胞浸潤，以及肉芽腫的形成等類似人類PBC的疾病表現。此外，該模型小鼠還表現出PDC-E2以及AMA的聚集、嗜酸性粒細胞的浸潤，80%的小鼠檢出AMA抗體陽性[16]。

雖然該小鼠模型制備周期短，操作便捷，但所有的小鼠均未檢測到人類PBC中所見的嚴重肝纖維化，并且在其他的組織器官，包括甲狀腺、腎臟、關節以及腸道中未發現慢性炎性，這也與人類PBC的疾病表現不相符。

2.3.2大腸桿菌免疫模型 除了新鞘氨醇桿菌外，大腸桿菌肽序列中有6-8個氨基酸殘基與人類PBC的PDC-E2具有同源性。將大腸桿菌以5×107cfu通過眶周靜脈叢注射入♀ 6周齡的NOD.B6Id10/Idd18小鼠體內，14 d后采用同樣方法再次注射，即可制備大腸桿菌誘導模型。

大腸桿菌誘導模型相比于新鞘氨醇桿菌誘導模型，小鼠表現出更嚴重的膽道疾病，而且血清AMA滴度更高，大腸桿菌感染4周后，小鼠血清AMA滴度達到峰值，然后逐漸下降至與新鞘氨醇桿菌感染小鼠相同水平。大腸桿菌感染26周后，小鼠肝臟出現明顯的匯管區炎癥反應，并且伴有肉芽腫的形成，此外小鼠出現程度不一的膽管損傷，輕度表現為淋巴細胞的聚集，重度膽管上皮細胞幾乎完全消失[17]。

雖然大腸桿菌誘導模型和新鞘氨醇桿菌誘導模型都未能使得小鼠表現出肝臟纖維化等人類PBC特征，且該類模型在制備時會造成小鼠合并發生尿路感染，降低模型制備的特異性，但是其為研究感染因素在PBC發病中的作用提供了新的思路。

2.3.3膽管蛋白免疫模型 BDP膽管蛋白(bile duct protein，BDP)模型，采用同系膽道抗原有效的破壞受體小鼠的免疫耐受。對野生型的8-12周齡C57BL/6J小鼠進行BDP分離，然后對7-8周齡的小鼠進行BDP免疫，即采用BDP乳液進行多點皮下注射，即可制得BDP免疫小鼠模型。

研究表明，同基因的膽道抗原能有效地破壞受體小鼠的免疫耐受，并且在BDP免疫小鼠中表現出PBC的幾個關鍵特征，包括肝臟匯管區的特異性炎癥浸潤，增加肝臟和脾臟的CD4+和CD8+T細胞數目和激活狀態。小鼠的AMA呈100%陽性，此外，在該模型中，肝臟和脾臟的Treg百分比都降低，這可能與T細胞的進一步激活有關[18]。

BDP模型突破了以往PBC模型的局限，以往并沒有研究集中在突破耐受性的經典模型，即用自體組織進行免疫。因此，BDP模型強調膽管抗原在PBC發病機制中的作用。此外，BDP模型的建立主要依賴膽管抗原，而人體內的膽管抗原可能反映分子擬態介導的環境因素，這與2-OA-BSA誘導的模型以及大腸桿菌誘導的模型相似。BDP模型強調的是通過激活自身免疫淋巴細胞耐受性崩潰的理論，這與基因突變所誘發的肝臟疾病不同。BDP模型也有著一些缺點和不足，在該模型中并沒有觀察到有肉芽腫的形成和膽管損傷，此外，該模型是否存在性別偏倚，仍有待進一步研究。

2.3.4純化的AMA-M2免疫模型 AMA是PBC的特異性抗體，9個亞型中以AMA-M2的特異性最強。而AMA-M2主要針對線粒體內膜上的PDC-E2抗原，這種抗原廣泛存在于體內的有核細胞中，并且AMA僅作用于肝膽管線粒體抗原，但機制目前仍不清楚。

將純化的PDC-E2、OGDC-E2、BCOADC-E2三聯體抗原，無菌鹽水稀釋(1 g·L-1)后，乳化于等體積的完全弗氏佐劑，腹腔注射(200 μL/只)接種于C57BL/6J小鼠，即可制備AMA-M2誘導模型。免疫66周后，100%模型小鼠體內出現AMA-M2抗體、血清ALP水平顯著升高，但模型小鼠肝臟并未出現淋巴細胞浸潤以及纖維化，雖然引起部分膽管損傷，但在其他組織器官中，如腎臟、胃和肌肉中也未觀察到淋巴細胞浸潤[19]。

該模型制備周期長，與人類PBC相似的血清學和病理學特征有限，但該小鼠模型穩定性高，可用于研究特異性抗體AMA-M2在PBC的作用。

2.4 基因自發模型

2.4.1NOD.c3c4小鼠模型 非肥胖糖尿病(Non-obese diabetic，NOD)小鼠可以自發自身免疫性Ⅰ型糖尿病，NOD.c3c4小鼠模型是第一個被報道的PBC自發小鼠模型，是在識別糖尿病的基因片段中偶然發現的。NOD.c3c4小鼠是在NOD小鼠的背景下，在其3號和4號染色體(c3/c4)上分別插入B6/B10來源的胰島素依賴性糖尿病(insulin dependent diabetes，Idd)的抗性等位基因。在B6和B10抗性等位基因與NOD基因組發生交互作用之后，導致了一種新型的可以遺傳控制的自身免疫性肝病，具有類似人類PBC的病理和生理特征。

NOD.c3c4小鼠模型表現出許多的肝臟組織病理學的異常，包括肝臟淋巴細胞浸潤、匯管區炎癥反應，以及受損膽管周圍嗜酸性粒細胞浸潤和上皮肉芽腫的形成。此外，50%-60%的小鼠在9-10周齡自發產生針對PDC-E2的自身抗體[20],80%-90%會產生抗核抗體，膽道上皮受累部位出現CD3+、CD4+、CD8+T細胞浸潤。此外，有報道稱對NOD.c3c4小鼠采用CD3單克隆抗體處理，可以使其免受自身免疫性肝病的侵害，但是在脾臟的過繼轉輸之后仍然會發生自身免疫性肝病[21]。這表明，T細胞在該疾病的發生中起著關鍵作用。

該模型與人類PBC不同的一個方面是膽道上皮細胞的增生，在該模型中，膽管損傷和淋巴細胞的浸潤先于膽管上皮細胞的增殖[3]。該模型具有比人類PBC更廣泛的膽管增生改變和自身免疫攻擊部位，NOD.c3c4小鼠以膽總管和肝內膽管為靶標，而PBC主要攻擊肝內中小膽管。

盡管NOD.c3c4小鼠模型具有許多和人類PBC相似的組織病理表型，但該模型仍存在AMA陽性率較低，血清ALP無法測得等缺點，此外該模型小鼠發病不存在性別偏倚。

2.4.2dnTGFβRⅡ小鼠模型 在NOD.c3c4小鼠模型造模成功后，研究者發現TGFβⅡ型受體顯性抑制(dominant-negative transforming growth factor-βreceptor type Ⅱ，dnTGFβRⅡ)轉基因小鼠模型可自發產生和人類PBC相似的組織病理學表現[22]。TGFβⅡ型受體是TGFβ在信號轉導的過程中至關重要的受體，它能夠調節淋巴細胞的活化。dnTGFβRⅡ小鼠在CD4啟動子的作用下過度表達TGFβ受體Ⅱ型顯性抑制基因，最終導致小鼠部分T細胞中的TGFβ信號缺失。而T細胞中的TGFβ信號維持了周圍Treg細胞，并以細胞自主的方式抑制T細胞的增殖、激活和分化，缺乏這種信號將會導致小鼠嚴重的自身免疫和早期死亡。

該模型小鼠針對人類PBC中的主要自身抗原PDC-E2、OGDC-E2以及BCOADC-E2自發產生AMA，并且呈100%陽性。dnTGFβRⅡ小鼠的肝臟組織學表明100%的小鼠在肝實質和門靜脈區有類似于人類PBC的CD4+、CD8+以及CD19+T淋巴細胞的浸潤。并且25%-50%的22周齡的小鼠，會產生膽管損傷，這一點也可見于人類的PBC[23]。此外，與人類PBC患者相似，dnTGFβRⅡ小鼠的肝臟中CD8+/CD4+T細胞的水平升高，血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-12 p40水平均顯著增加[22]。dnTGFβRⅡ小鼠表現出和人類PBC相似的主要血清學和組織學特征，這表明TGFβ信號轉導在PBC的發病中可能起著至關重要的作用。

dnTGFβRⅡ小鼠也具有許多與人類PBC的不同之處，該模型小鼠不存在類似于人類PBC的性別偏倚，肝內無嗜酸性粒細胞浸潤，肉芽腫形成也不明顯。

此前有報道，將dnTGFβRⅡ小鼠脾臟的CD4+以及CD8+T細胞過繼轉移到Rag1-/-小鼠體內，結果Rag1-/-小鼠出現了類似人類的PBC疾病表現，表明脾臟的T細胞以及B細胞的耐受性的喪失導致了PBC。為了進一步研究T細胞在PBC發病中的作用，分別將CD4+以及CD8+T細胞轉移到Rag1-/-小鼠體內，結果CD4+T細胞轉移的Rag1-/-小鼠出現了結腸炎，而CD8+T細胞轉移的Rag1-/-小鼠出現了類似于人類PBC的疾病表現，這表明，CD8+T細胞在膽管損傷中起著至關重要的作用[23]。將dnTGFβRⅡ小鼠與B細胞缺陷小鼠(Igμ-/-小鼠)進行雜交，用以評估B細胞在肝臟的炎癥浸潤以及伴隨的結腸炎中的作用。結果表明，Igμ-/-dnTGFβRⅡ小鼠表現出更嚴重的膽管損傷以及結腸炎，提示B細胞在dnTGFβRⅡ小鼠中具有抑制炎性浸潤的作用[24]。為了進一步確認B細胞在dnTGFβRⅡ小鼠組織病理中的作用，對幼齡小鼠(4-6周)以及成年小鼠(20-22周)分別進行B細胞耗竭治療。結果表明，幼齡小鼠在經過治療后，其肝臟的炎癥浸潤情況以及血清AMA水平明顯降低，但是結腸炎有加重傾向，同樣對于已經發病的成年小鼠進行治療則無效，提示，B細胞在PBC的發病過程中起著雙向的作用[25]。除了在T、B細胞的研究上提供了新的思路外，dnTGFβRⅡ小鼠也被應用于CD-1d限制NKT細胞、IFN-γ和IL-12在PBC病理過程中的作用的研究，為PBC的病理學和免疫學研究中提供了新的思路和方法。

2.4.3IL-2R-/-小鼠模型 白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)對于CD4+、CD25+Treg細胞亞群的發育和外周擴張起著至關重要的作用，而CD4+、CD25+Treg細胞可以通過抑制T細胞的體內反應提高機體的自我耐受性。

將C57BL/6J背景來源的小鼠敲除IL-2R基因后，IL-2R-/-小鼠產生與慢性非化膿性破壞性膽管炎相似的血清學和病理學特征，這也可見于人類PBC。IL-2R-/-小鼠血清學檢測呈現出100%的AMA的陽性，此外，IL-2R-/-小鼠的匯管區炎性細胞浸潤增多，并且CD8+/CD4+T細胞的比例也有所升高。與dnTGFβRⅡ小鼠的過繼轉移實驗所表明的結果相同，敲除CD4+T細胞的IL-2R-/-實驗小鼠表現出結腸炎的發生以及嚴重程度的降低，而敲除CD8+T細胞的IL-2R-/-結腸炎的小鼠則表現出缺乏膽管損傷的病理學表現，同樣提示CD8+T細胞是PBC發病過程中的關鍵細胞[26]。

值得注意的是，IL-2R-/-小鼠表現出嚴重的自身免疫性膽管炎的同時，也伴隨發生全身的腸道疾病，25%-50%的小鼠在8-20周齡的時候死于嚴重的溶血性貧血。

AE2a,b-/-小鼠表現出和人類PBC相似的疾病表現，血清學檢測發現除AMA升高外，IgG、IgM以及ALP的水平均升高。此外，該模型小鼠還表現出脾腫大，IL-12 p70和IFN-γ的水平升高，CD4+Foxp3+Treg表達減少。約1/3的小鼠會發生膽管損傷，損傷膽管周圍以及匯管區可見CD4+、CD8+T細胞浸潤[27]。

雖然AE2a,b-/-小鼠在研究PBC的發病機制方面起到了一定的作用，但是該模型仍存在發病遲緩、不存在性別偏倚、難以繁衍以及AMA陽性率低等問題，為其應用帶來了一定的限制。

2.4.5ARE-Del-/-小鼠模型 ARE-Del-/-小鼠模型和人類PBC具有高度相似的疾病表現，該模型是通過敲除IFN型基因3'非翻譯區中具有162 nt的腺嘌呤尿嘧啶富含元件(adenylate uridylate-rich element，ARE)而形成的[28]。

ARE-Del-/-小鼠存在著類似人類PBC發病的女性偏倚現象，20周齡的雌性小鼠的肝臟可觀察到中度到重度的淋巴細胞浸潤，而同樣條件下的雄性小鼠只有輕度到中度的淋巴細胞浸潤。此外，雌性ARE-Del-/-小鼠的匯管區和肝小葉炎癥、小膽管的破壞較嚴重，也可觀察到明顯的肉芽腫的形成，雌性小鼠還可見輕度的肝纖維化，而雄性小鼠則無法觀測到。在血清學特征上，8-10周齡的雌性小鼠可觀察到抗PDC-E2、OGDC-E2以及BCOADC-E2等自身抗體，其中主要是抗PDC-E2自身抗體。而在20周齡時，雌性小鼠AST、ALT以及總膽汁酸水平較雄性小鼠均明顯升高。

報道稱，將ARE-Del-/-小鼠CD4+T細胞轉移至B6/Rag1-/-小鼠體內，引起受體小鼠發生匯管區以及肝實質的炎癥浸潤，并且膽管損傷和肉芽腫的形成降到最低，此外，在CD4+T細胞轉移后，受體小鼠血清IFN-γ、TNF-α以及IL-6的水平均顯著升高，而采用相同方法將ARE-Del-/-小鼠的CD8+T細胞轉移至B6/Rag1-/-小鼠后，受體小鼠僅發生輕度的匯管區和肝實質炎性浸潤，無肉芽腫形成，IFN-γ、TNF-α以及IL-6等血清學指標也無顯著變化，提示CD4+T細胞在ARE-Del-/-小鼠的發病機制中起著關鍵的作用。性別偏倚是ARE-Del-/-小鼠模型的優勢之一，在雌性小鼠中，差異表達的基因具有更強的Ⅰ型和Ⅱ型干擾素信號和淋巴細胞介導的免疫反應，可能是導致該模型小鼠產生類似人類PBC的女性偏倚的原因?？傊?，改變IFN-γ表達在PBC的發病機制中至關重要[29]。

3 總結

PBC是一種以AMA的存在和肝內膽管進行性破壞為特征的肝臟特異性自身免疫性疾病，其發病過程可能涉及環境、遺傳易感性、免疫耐受異常等多種因素。由于PBC的發病涉及多種因素，其臨床過程可能較為復雜，因此，利用動物模型對闡明PBC的發病機制具有一定的價值。

Tab 1 Comparison between human PBC and murine models of PBC

本文綜述了手術模型、藥物誘導模型、抗原免疫模型以及基因自發小鼠模型，雖然目前針對PBC的動物模型種類繁多，但也正因PBC的發病機制的復雜性，現有動物模型還不能夠完全模擬人類PBC的疾病表現，每一種動物模型在模擬人類疾病上都有其獨特的優勢和不足。手術模型制備簡單、成本低廉，在研究膽汁淤積方面方法成熟、成模率高；藥物誘導模型通過藥物來誘導小鼠自身免疫耐受失調，最終導致發生類似人類PBC的疾病表現，該類模型的制備驗證了環境因素在PBC發病中的關鍵作用；而抗原免疫模型利用自身抗原或和自身抗原具有氨基酸同源性的異種抗原免疫小鼠，強調了在PBC發病過程中，自身抗原以及感染因素的作用；基因自發模型均可自發產生類似人類PBC的疾病特征，在研究天然免疫和適應性免疫在PBC發病過程中的作用有著獨特的優勢，但該類小鼠成本較高，并且大多數的基因自發小鼠存在著難以繁衍等問題。事實上，每一種動物模型都各有優劣，由于PBC發病機制的復雜性，任何單一的動物模型都很難完全模擬其疾病表現，但也正是這些各有優劣的動物模型的共同使用研究，讓我們對PBC有了更進一步的了解。而正因為我們目前對PBC的了解，將會促進我們在未來開發更加合適匹配的動物模型，也將促進對PBC發病機制的進一步探索和治療藥物研發。