亞油酸通過調節TLR4/NF-κB信號通路減輕大鼠類風濕關節炎

胡丹東， 崔玉娟, 張 繼

(1.北京市延慶區食品藥品安全監控中心，北京 102100；2.西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730070； 3. 北京市延慶區疾病預防控制中心，北京 102100)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的慢性、炎癥性和進行性自身免疫性疾病。RA患者的早期病理特征主要是滑膜炎和關節腔內血管翳的形成[1]。慢性炎癥促進RA的發展，在發展過程中巨噬細胞的極化、成纖維樣滑膜細胞的異常增殖、炎性因子等原因導致關節軟骨的破壞和周圍組織的損傷[2]。如果患者得不到及時、正規的治療，就會造成關節畸形，甚至最終發展為肢體殘疾。此外，RA患者易合并腦卒中、心肌梗死等疾病，是致殘的主要原因，在一定程度上導致社會勞動的喪失[3]。 根據流行病學資料，全世界RA發病率約為1%[4]，因此，RA已成為嚴重的公共衛生問題。

在現代治療的幫助下，大多數RA患者可以有效地控制病情，改善癥狀，減輕疼痛，保護關節功能[5]。 但到目前為止，還沒有治療RA的特效藥，治療方法主要包括藥物治療、物理治療、手術治療和免疫吸附治療，其中，藥物治療作為應用最廣泛和最有效的方法，在RA的治療中起著關鍵作用[6]。亞油酸是一種功能性的多不飽和脂肪酸，據報道其具有降低血清膽固醇水平、抑制動脈血栓形成、預防癌癥、參與人類心血管疾病的控制、免疫調節、細胞生長和細胞凋亡等作用。此外，亞油酸用于治療關節和肌肉的炎癥和疼痛[7]。還有文獻報道，亞油酸可促進傷口愈合，減少傷口愈合過程中的炎癥細胞數量，并顯著抑制炎癥因子水平[8]。然而，亞油酸在RA治療中的潛在作用和可能機制尚未闡明。

RA的病因尚不清楚，但已發現NF-κB信號通路在RA的發展中具有重要作用，相關研究表明可以通過抑制NF-κB信號通路發揮抗RA作用[9]。此外，近年來TLR4已被發現對RA的病理反應有重要影響，其作用機制與RA患者滑膜中TLR4的表達水平高于健康人有關[10]；隨著研究的不斷深入，姜黃素、青藤堿等植物提取物均可通過阻斷或抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕和預防炎癥反應，改善RA，成為治療RA的潛在藥物。因此，TLR4/NF-κB信號通路在RA的發病機制中起著重要作用。

因此，本研究旨在探討亞油酸在治療RA中的作用及其可能的機制。研究發現亞油酸通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕炎癥反應，改善膠原誘導的RA，研究結果為亞油酸在RA中的生物學功能提供了新的認識，并為RA的治療提供了一種新的藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物從上海實驗動物研究中心(中國)購買的36只體質量為(250-300)g的雄性SD大鼠。所有動物都被安置在控制溫度(22 ℃)、濕度(50%)和光照(12 h光照/黑暗)下，自由獲得標準飲食和水。

1.2 大鼠RA模型的建立及實驗分組RA大鼠模型的建立，將Ⅱ型膠原溶解于0.05 mol·L-1醋酸溶液中，配成濃度為2 g·L-1的溶液，等體積加入膠原溶液與完全弗氏佐劑乳化，采用免疫注射法在尾根部皮內注射100 μg膠原乳劑，在d 7加強免疫。將SD大鼠分為6組，每組6只，包括：對照組、RA模型組、RA+亞油酸(0.1 mL)組、RA+亞油酸(0.2 mL)組、RA+亞油酸(0.4 mL)組和RA+甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)(20 mg·kg-1)組。對照組和模型組只給予0.9%生理鹽水，其他組給予各體積亞油酸及10 mL·kg-1MTX處理，連續灌胃7 d。然后處死大鼠，分別在不同時間測定各組大鼠的關節腫脹、足體積、足厚、關節周長。亞油酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：111622-201704、含量：99.8%、規格：0.2 mL/支)、MTX(中國食品藥品檢定研究院，批號：100138-201606、含量：99.8%、規格：400 mg/支)。

1.3 HE染色關節軟骨組織固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋，切片厚4 μm，用蘇木精染色10 min，室溫用伊紅處理5 min，組織學圖像在光學顯微鏡下放大200倍獲得。CX43光學顯微鏡(奧林巴斯株式會社，日本)。

1.4 ELISA檢測采集血清樣本，分析細胞因子釋放情況。300 g血清在4 ℃下離心(2 000-3 000 r·min-1)15 min，收集上清液。用ELISA法檢測血清樣本中的IL-1、IL-6、TNF-α和IL-10蛋白水平。ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，中國)，MK3酶標儀(美國熱電公司，美國)。

1.5 qRT-PCR用TRIzol(碧云天生物技術研究所，中國)法從關節軟骨組織中提取總RNA，用TaqMan一步法將RNA反轉錄成cDNA。通過ABI 7500實時熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司，美國)進行qRT-PCR實驗。用2-ΔΔCt法計算IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的相對mRNA表達水平。以GAPDH為內標，特異性引物如Tab 1所示：

Tab 1 Specific primer sequence, forward and reverse primer sequences of IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-10, GAPDH

反應體系為：2×SYBR?Green Realtime PCR預混液12.5 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA模版2 μL，加ddH2O至25 μL。循環為：95 ℃變性5 min；95 ℃持續15 s、55 ℃持續15 s、72 ℃持續10 s，進行40個循環；72 ℃延伸5 min。

1.6 Western blot檢測用RIPA裂解緩沖液分離關節軟骨組織中的蛋白質，BCA試劑盒(碧云天生物技術研究所，中國)定量。再用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白質，并轉移到PVDF膜上(Millipore，MA，美國)。然后，用5%脫脂乳封閉膜，并在4 ℃下過夜，用抗TLR4(1 ∶1 000，ab22048)、抗p-NF-κB p65(1 ∶1 000，ab86299)、抗NF-κB p65(1 ∶1 000，ab16502)和抗GAPDH(1 ∶2 000，ab181602)等一抗處理。用HRP結合二次抗體(1 ∶2 000，ab6728)在室溫下沖洗1 h。最后，用增強化學發光試劑盒(ECL，Millipore，Bedford，MA，美國)觀察蛋白質印跡。所有抗體均來自Abcam(MA，美國)。

1.7 免疫組織化學法用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片5 μm。用TLR4(1 ∶100，ab22048)、p-NF-κB p65(1 ∶100，ab86299)抗體對組織進行免疫染色。然后用生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白G二次抗體孵育，在37 ℃下1 ∶500稀釋，再次孵育30 min，用DAB作顯色劑。圖像在光學顯微鏡下獲取，CX43光學顯微鏡(奧林巴斯，日本)；所有抗體均來自Abcam (MA，美國)。

2 結果

2.1 亞油酸對RA大鼠關節腫脹的影響構建Ⅱ型膠原誘導的RA大鼠模型，通過不同劑量亞油酸和MTX的處理，探討亞油酸對RA大鼠關節腫脹的影響。如Fig 1A所示，Ⅱ型膠原誘導的RA大鼠關節與對照組相比腫脹明顯，而亞油酸顯著改善了RA大鼠的關節腫脹。此外，還測量了不同組在相應天數下的足部體積、足部厚度和關節周長，如Fig 1B-D所示，RA大鼠足部體積、足部厚度和關節周長數據明顯大于對照組，而經過亞油酸處理后都得到了顯著改善(P<0.01)。實驗結果表明，亞油酸有效改善了Ⅱ型膠原誘導的大鼠RA導致的關節腫脹。

2.2 亞油酸對RA大鼠關節病理損傷的影響對不同分組的RA大鼠關節軟骨組織進行了HE檢測。如Fig 2A所示，對照組大鼠關節軟骨表面光滑，層次完整，滑膜下層細胞分散且少，無炎癥或骨質破壞。而RA大鼠關節部位表現出典型的病理特征，如滑膜細胞顯著增加、滑膜增生、伴有炎性細胞浸潤和血管翳形成，關節軟骨和骨嚴重破壞，經亞油酸處理后明顯減輕了RA大鼠的上述現象。 結果表明亞油酸可改善RA大鼠關節病理損傷。

Fig 1 Effects of linoleic acid on joint swelling in RA rats n=6)

Fig 2 Effects of linoleic acid on joint pathological injury in RA rats n=6)

2.3 亞油酸對RA大鼠炎癥反應的影響采用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等炎性因子的表達水平。如Fig 3A所示，與對照組相比，Ⅱ型膠原誘導的RA大鼠TNF-α等炎性因子表達量明顯增加，而與模型組相比，亞油酸處理后抑制RA大鼠炎性因子表達(P<0.05)。同時，qRT-PCR對炎性因子的mRNA測定也得到了相同的結果，如Fig 3B所示，與模型組相比，隨著亞油酸的增加明顯降低了Ⅱ型膠原誘導的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的mRNA表達水平。這些數據表明亞油酸能改善RA大鼠的炎癥反應。

2.4 亞油酸對RA大鼠TLR4/NF-κB信號通路表達的影響采用免疫組化和Western blot方法檢測亞油酸對TLR4/NF-κB信號通路表達的影響。如Fig 4A所示，亞油酸劑量的增加抑制了TLR4/NF-κB信號通路蛋白TLR4和p-p65在組織中的陽性產物表達；Fig 4B所示亞油酸抑制了TLR4/NF-κB信號通路TLR4的表達以及p65蛋白的磷酸化，通過免疫組織化學法和Western blot的檢測結果可以明顯看到抑制趨勢(P<0.05)。結果顯示亞油酸抑制RA大鼠TLR4/NF-κB信號通路的表達，通過調節TLR4/NF-κB信號通路改善Ⅱ型膠原誘導的大鼠RA。

Fig 3 Effects of linoleic acid on inflammatory response in RA rats n=6)

Fig 4 Effects of linoleic acid on expression levels of TLR4/NF-κB signaling pathway in articular cartilage tissues of RA rats n=6)

3 討論

近年來，RA的臨床治療取得了很大進展，主要體現在生物改良抗風濕藥物和小分子靶向抑制劑，包括TNF抑制劑、IL-6抑制劑、抗T細胞共刺激藥物、抗B細胞藥物等，盡管這些生物制劑的作用靶點不同，但研究人員發現這些藥物最終都是通過干擾RA的炎癥進程發揮作用[11]。雖然近年來RA的治療取得了很大的進展，但目前這些治療藥物只能部分緩解病情的進展，在RA的治療方面仍然存在巨大的挑戰，這說明開發和篩選新的治療藥物仍然具有重要意義。植物提取物具有資源豐富、細胞毒性相對較小、易獲得、成本低廉等諸多積極優勢。因此，本研究旨在探討亞油酸在RA發生發展過程中的可能作用及其機制，體內研究表明亞油酸能明顯改善關節腫脹、足部體積、足部厚度，RA大鼠關節周長及關節病理損傷。

RA是一種自身免疫性疾病，其基本病理改變為滑膜炎[12]。研究表明，RA活動期血清和滑膜中炎性細胞因子的表達發生了變化，這些細胞因子中最重要的是TNF-α和IL-1β，它們通常同時存在于炎性細胞中，并且相互作用，其主要機制是激活血管內皮細胞，增強內皮細胞粘附分子的表達，從而聚集關節腔中的白細胞發揮炎癥作用，引起相應的臨床癥狀和的軟骨破壞[13]，同時炎性反應可刺激TNF-α和IL-1β的合成，從而形成惡性循環。TNF-α主要影響滑膜炎的嚴重程度，而IL-1β對軟骨破壞有更大的影響，IL-6和IL-10也與RA的進展密切相關[14]。所以，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10作為觀察指標可以客觀、系統地反映RA的病情。因此，本研究進行了ELISA和qRT-PCR檢測，數據顯示亞油酸可抑制Ⅱ型膠原誘導的RA大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的蛋白表達水平和mRNA表達水平。

NF-κB信號通路在RA的發生發展中起著重要作用，因此受到越來越多的關注[15]。NF-κB是一種多效性核轉錄因子，存在于幾乎所有類型細胞的細胞質中，通常以非活性形式存在，在細胞活化、淋巴細胞發育、應激反應、凋亡等細胞活動中發揮重要作用。NF-κB的激活可提高TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、粘附分子、G-CSF和COX-2的轉錄水平，同時對TNF-α、IL-1β等多種炎癥介質進行正調控和促進[16]，而TNF-α和IL-1β可進一步激活NF-κB的表達，從而形成惡性循環，并導致RA反應和結構損傷的維持和進展[17]，因此，阻斷RA患者病理狀態下NF-κB的激活可以下調炎性細胞因子的表達，從而阻斷RA的發展。最近的研究表明TLR4與RA的進展和發展密切相關，并在RA患者中高度表達[18]，TLR4一種I型跨膜蛋白，并表達于多種組織細胞中，并通過 NF-κB途徑啟動細胞內的信號轉導。TLR4/NF-κB信號通路是RA發病過程中重要的炎癥相關通路之一，細胞膜上的TLR4將信號傳遞給細胞質中的NF-κB、p65，激活NF-κB二聚體從細胞質到細胞核的易位，指導相關基因的轉錄和翻譯，促進細胞分泌下游產物，進一步影響RA的進展和發展，TLR4/NF-κB信號通路已被證明是RA治療的靶向途徑。在本研究中，通過免疫組化法發現亞油酸抑制RA大鼠TLR4/NF-κB信號通路中TLR4和p-p65的表達，同時WB檢測也得到了相同的結果。

總之，亞油酸能夠抑制RA導致的炎性反應，其機制與亞油酸能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路TLR4和p-p65的蛋白表達水平，進而抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的表達有關，通過實驗證實了亞油酸通過抑制炎癥反應和阻斷TLR4/NF-κB信號通路對RA具有潛在的治療作用。因此，為亞油酸可能成為RA治療藥物提供了依據。