白首烏C-21甾體總苷通過TGF-β1/Smad信號通路干預人肝星狀細胞活化的機制

張 婷，丁永芳，彭蘊茹

(1.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，2.江蘇省中醫藥研究院，江蘇 南京 210028)

肝臟纖維化是指肝細胞出現壞死及炎癥刺激后，肝臟內大量纖維結締組織異常增生，膠原合成與降解異常的病理過程。肝纖維化是發展到肝硬化的必經階段，因此，有效阻斷肝纖維化的發生發展，對防治肝硬化及肝癌具有重要意義。肝纖維化是肝內多種細胞及多個因素共同作用的結果，而肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)在其中發揮了關鍵性作用。持續的損傷刺激肝臟內免疫細胞釋放炎癥因子，HSC由靜止轉化為活化狀態，最終具有肌成纖維樣細胞表型[1]。HSC是肝臟內主要的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)生成細胞，活化的HSC主要特征為強增殖力，表型改變，ECM異常累積[2]。持續不斷的ECM沉積導致肝臟臟器損傷，失去基本生理功能。轉化生長因子-β(transforming growth factor，TGF-β1)是目前研究較多的一種促纖維化細胞因子，參與肝病各個階段并發揮重要作用[3]。而脂多糖(lipopolyscaccharide，LPS)是一種細胞毒素，可以釋放炎性細胞因子，對HSC也有一定的激活作用，可參與肝臟損傷-炎癥-纖維化的過程[4]。有研究[5]顯示，TGF-β1與LPS可以分別激活LX-2細胞建立體外纖維化模型，促進纖維化的進程，但其協同作用的具體機制尚不清楚。

活化的HSC大量表達TGF-β1，Smad是TGF-β1下游靶點，主要是通過調節TGF-β1/Smad信號通路推動纖維化進程[6-7]。Smad家族中Smad2，Smad3活化后主要分布在細胞核內，持續活化HSC，增加合成ECM蛋白的表達，自分泌大量TGF-β1持續激活HCS，加速肝纖維化進展。因此，研究TGF-β1/Smad信號通路對于闡釋藥物抗肝纖維化作用機制有重要意義。

白首烏是傳統補益類中藥，C-21甾體是從白首烏中發現的數量最多、也是最主要的活性成分。本課題組前期研究[8-9]表明，白首烏C-21甾苷(TCSG)具有顯著的抗肝纖維化作用。但迄今為止，白首烏C21甾苷對肝星狀細胞活化的影響及作用機制尚未深入研究。本研究擬采用TGF-β1聯合LPS誘導人肝星狀細胞LX-2的活化從而模擬體外肝纖維化發病過程，并在此基礎上研究TCSG對LX-2活化的影響，以及通過TGF-β1/Smad信號通路闡明TCSG發揮抗肝纖維化的內在分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑，儀器及細胞 白首烏C-21甾體總苷(TCSG)提取物由本院中藥資源研究室錢仕輝教授課題組提取并經比色法測定C-21甾體總苷的質量分數為52.89%。脂多糖(Sigma，Lot：L2880-100MG)；TGF-β1(PEPRO TECH，Lot：1218209)；Alexa FluorTM488 donkey anti-rabbit IgG(H+L)(Invitrogen，Lot：2045215)；BCA蛋白濃度測定增強型試劑盒(碧云天，Lot：091919200430)；GAPDH、α-SMA、NF-κB、IκB-α、p-Smad3(Cell Signaling，批號分別為：#2118、#19245、#8242、#2859、#9520)；p-Smad2、Smad2、Smad3、TGF-β1(Abcam，批號分別是：ab53100、ab40854、ab40854、ab92486)；二抗山羊抗兔IgG(Jackson Immuno Research，Lot：147832)；羥脯氨酸試劑盒(堿)(南京建成生物工程研究所，A030-2-1)；DMEM(HyClone，Lot：AE29423688)；胎牛血清(Gibco，Lot：2166451)。Millicell EZ SLIDE(MILLIPORE)；倒置熒光顯微鏡(LEICA，DMi8)，酶標儀(Thermo，Multiskan FC)，電泳儀器(Bio-Rad)。人肝星狀細胞株(LX-2)購于中南大學。

1.2 實驗方法

1.2.1LX-2細胞培養 LX-2在含1%雙抗和10% FBS的DMEM高糖培養基中培養，置于37 ℃、5% CO2條件下培養，每2-3 d換液一次，在顯微鏡下觀察直到細胞密度達到對數生長期后進行傳代及凍存。

1.2.2MTT法檢測細胞活力 取密度為8×106個·L-1的細胞懸液，100 μL/孔加入96孔培養板中，每組6個復孔。實驗分為對照組和不同濃度(20、40、60、80、100 mg·L-1)TCSG藥物組，除對照組外，其余每組加入相應濃度的TCSG，分別孵育24、48、72 h后，加入20 μL新鮮配制的MTT(5 g·L-1)溶液37 ℃孵育4 h，小心棄去上清液，每孔中加入200 μL的DMSO溶液，振搖10 min，保證藍色甲瓚充分溶解于DMSO中，設定波長490 nm，采用全自動酶標儀，在相應的波長下讀取并記錄吸光度值。

1.2.3細胞免疫熒光染色法觀測α-SMA表達情況 取密度為4×106個/L的細胞懸液，接種于Millicell EZ SLIDE (8-well glass)培養板中，300 μL/孔，培養24 h后進行分組和藥物處置。實驗設對照組，TGF-β1+LPS組，TGF-β1+LPS聯合 不同濃度的TCSG藥物干預(10、20、40 mg·L-1)組。TGF-β1+LPS組分別加入終濃度為10 μg·L-1的TGF-β1和10 mg·L-1的LPS，藥物干預組在加入誘導劑TGF-β1和LPS同時，加入終濃度為10、20、40 mg·L-1的TCSG，對照組加入相應體積的DMEM。處理24 h后，PBS洗滌3次/5 min，4%多聚甲醛冰上固定20 min，PBS洗滌3次/5 min，0.5% Triton X-100冰上透化15 min，含3% BSA的PBS室溫封閉45-60 min。一抗(抗α-SMA抗體1 ∶200)4 ℃孵育過夜。次日，室溫孵育30 min，暗室熒光二抗(Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG(H+L)1 ∶500)室溫孵育1 h。核染料DAPI(5 mg·L-1)染細胞核，室溫孵育5 min后用PBS緩沖液洗滌3次/5 min，每孔隨機選擇3個視野熒光顯微鏡下拍攝。

1.2.4羥脯氨酸含量檢測 取細胞密度為8×106個/L細胞懸液，接種于12孔培養板中，每組3個復孔。24 h后藥物處置方法同“1.2.3”，24 h后收集各孔培養液上清，按照羥脯氨酸堿水解法檢測試劑盒說明書操作流程，檢測細胞上清液中的羥脯氨酸含量變化情況。

1.2.5Western blot 實驗分組同“1.2.4”。收集細胞加入細胞裂解液200 μL/孔，冰上裂解30 min。期間每10 min用移液器吹打至混懸狀態。在4 ℃條件下，以12 000 r·min-1離心15 min，小心吸取上清液。100 ℃變性10 min，取等量蛋白質進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后室溫封閉1 h，棄掉牛奶，一抗4 ℃過夜。次日，回收一抗，室溫孵二抗1 h，洗膜3次，ECL化學發光顯影液顯影。蛋白條帶采用ImageJ軟件檢測灰度值，通過目標蛋白與內參蛋白(GAPDH)灰度值比較分析。

2 結果

2.1 TCSG對LX-2細胞增殖的影響MTT結果顯示：與對照組相比較，不同濃度的TCSG(20、40、60、80、100 mg·L-1)處理LX-2細胞24 h，細胞增殖沒有明顯抑制作用；處理LX-2細胞48 h，與對照組比較，40、60、80、100 mg·L-1TCSG均對細胞增殖有顯著抑制作用(P<0.05,P<0.01)；處理細胞72 h，各個濃度TCSG(20、40、60、80、100 mg·L-1)均顯著抑制細胞增殖(P<0.05,P<0.01)。實驗結果表明一定濃度的TCSG作用于細胞48 h以上，可以抑制肝星狀細胞LX-2的增殖，并且呈現劑量依賴性，所以后續實驗選擇10、20、40 mg·L-1TCSG作為抑制LX-2細胞活化的濃度，以避免藥物產生毒性。

2.2 TCSG對活化的LX-2細胞α-SMA表達的影響免疫熒光染色結果如Fig 2所示，綠色熒光的深淺表示α-SMA蛋白在LX-2細胞內的表達水平，綠色越深，分布越密集，表明α-SMA蛋白表達水平越高，DAPI染胞核呈藍色熒光。對照組呈現微弱的綠色熒光，分散稀疏，表示α-SMA的蛋白表達水平較低；TGF-β1聯合LPS處理LX-2細胞24 h，綠色熒光強度明顯增強，表示α-SMA蛋白表達水平較高；10、20、40 mg·L-1TCSG處理LX-2細胞24 h，綠色熒光強度明顯減弱，表示α-SMA蛋白表達水平降低。說明TGF-β1聯合LPS刺激提高了LX-2細胞中α-SMA蛋白表達，10、20、40 mg·L-1TCSG可以降低α-SMA在LX-2細胞內的表達水平。

Fig 1 Effect of TCSG on cell

Fig 2 Expression of α-SMA in LX-2 cells observedby immunoflouresence(×400)

2.3 TCSG對活化的LX-2細胞HYP含量的影響如Fig 3所示，與對照組相比較，模型組中LX-2細胞上清液HYP含量升高(P<0.01)。與模型組相比較，TCSG藥物組中LX-2細胞上清液HYP含量降低(P<0.05)。提示TCSG具有劑量依賴性降低LX-2細胞上清液HYP水平。

2.4 TCSG處理組對LX-2纖維化及炎癥相關蛋白表達的影響與對照組相比，模型組LX-2細胞上TGF-β1、NF-κB、α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量升高(P<0.05)。IκB-α蛋白相對表達明顯降低。與模型組相比，TCSG藥物組LX-2細胞上TGF-β1、NF-κB、α-SMA、p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3蛋白相對表達量明顯降低，而IκB-α蛋白相對表達量升高(P<0.05)(Fig 4A，B)。提示TCSG可能通過調節TGF-β1/Smad信號通路抑制LX-2細胞活化發揮抗肝纖維化作用。

Fig 3 Effect of TCSG on hydroxyproline content

Fig 4 Effects of TCSG on protein expression of TGF-β1,α-SMA,NF-κB,IκB-α,p-Smad2/Smad2 and

3 討論

肝星狀細胞(HSC)活化，細胞外基質(ECM)異常沉積，最終導致肝纖維化。多項研究[10-11]表明，TGF-β1是目前研究最多的導致纖維化的細胞因子，在細胞外，胞質與胞核內均有表達。體內TGF-β1可以通過旁分泌及自分泌激活HSC細胞，大量產生α-SMA及膠原等，推動肝纖維化發展。有研究[12]表明，Smad信號通路是TGF-β1調控的主要細胞內信號通路。TGF-β1與細胞表面TGF-β受體結合，激活下游Smad家族中Smad2、Smad3，導致Smad2和Smad3磷酸化，增加纖維化標志物α-SMA，TGF-β1蛋白表達及膠原合成，活化HSC細胞[13-14]。有文獻[15-16]表明，LPS通過刺激HSC細胞，引起炎癥反應，大量分泌促炎性因子，激活HSC細胞。其中NF-κB是LPS誘導炎癥發生過程中重要的轉錄因子，調節多種炎癥因子的基因表達。其中IκB-α是存在于細胞質中的NF-κB抑制因子，通常情況下與NF-κB結合形成無活性的復合物，當對刺激做出反應時，IκB-α被IκB激酶磷酸化后轉移并降解[17-18]。活化的NF-κB信號通路激活TGF-β1的表達，持續活化HSC，上調纖維化標志物α-SMA蛋白表達。

基于本課題組前期體內實驗研究表明白 首烏C-21甾苷抗肝臟纖維化的工作基礎，本實驗以體外人肝星狀細胞(LX-2)纖維化模型為研究對象，進一步研究TCSG調控NF-κB/TGF-β1/Smads信號通路抗肝纖維化的內在分子機制。TGF-β1聯合LPS建立體外肝纖維化模型，免疫熒光結果顯示纖維化標志物α-SMA蛋白表達升高，細胞上清液中羥脯氨酸含量增加，Western blot結果顯示LX-2細胞中TGF-β1、NF-κB、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白比值表達升高，IκB-α蛋白表達降低。TCSG干預后，免疫熒光結果顯示纖維化標志物α-SMA表達明顯降低，細胞上清液中羥脯氨酸含量降低，Western blot結果顯示LX-2細胞中TGF-β1、NF-κB、Smad2、Smad3與其磷酸化蛋白比值表達降低，IκB-α蛋白表達升高。

綜上所述，中藥白首烏主要成分TCSG對TGF-β1及LPS共同誘導的體外肝纖維化模型具有明顯的干預作用。可能是通過抑制Smad2與Smad3蛋白磷酸化水平，下調TGF-β1、α-SMA、NF-κB蛋白表達，抑制IκBα降解，調控NF-κB/TGF-β1/Smad信號通路，抑制人肝星狀細胞活化起到抗纖維化作用。