白藜蘆醇調(diào)控miR-223對(duì)壞死性小腸結(jié)腸炎小鼠細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制

王 瑛，張瑩楠，常新捷，張英劍

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.兒外科、2.消化內(nèi)科， 河南 洛陽(yáng) 471000)

壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是一種常見(jiàn)于早產(chǎn)兒的急性腸道炎癥性疾病，是造成新生兒致殘、致死的重要因素[1]。流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示，在新生兒體質(zhì)量低于1.5 kg的早產(chǎn)兒中NEC發(fā)病率高達(dá)7%，致死率高達(dá)20%-30%[2]。由于NEC病情的反復(fù)性、嚴(yán)重性以及復(fù)雜性，有關(guān)其確切機(jī)制尚不完全清楚。目前研究表明，早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)、炎癥風(fēng)暴等與NEC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。細(xì)胞焦亡是一種新型的炎癥性、程序性細(xì)胞死亡方式，其主要是由caspase-1/3/4/5/11介導(dǎo)GSDMD剪切形成具有細(xì)胞毒性的GSDMD-N和無(wú)毒性的GSDMD-C，其中GSDMD-N募集至細(xì)胞膜與磷脂分子結(jié)合形成GSDMD-N細(xì)胞孔洞，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-18釋放，并最終導(dǎo)致機(jī)體強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[4]。在大鼠NEC模型中，細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)顯著升高[5]。另外，在小腸上皮細(xì)胞中，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能夠通過(guò)促進(jìn)NLPR3炎癥小體活化誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡并加快小腸上皮細(xì)胞死亡，抑制NLRP3能夠抑制LPS誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞焦亡，緩解NEC腸道損傷[6]。以上研究均表明，細(xì)胞焦亡參與了NEC腸道損傷的病理過(guò)程。因此，通過(guò)探尋有效藥物調(diào)控細(xì)胞焦亡可能成為治療NEC的重要方式。

白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是一類存在于葡萄、花生、虎杖等多種植物內(nèi)的多酚類有機(jī)化合物。既往研究顯示，RSV具有廣泛的藥理學(xué)活性，主要對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等疾病中的組織和細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡、抑制炎癥反應(yīng)的作用[7]。新近研究顯示，RSV能夠能夠通過(guò)抑制NLRP3表達(dá)，緩解LPS誘導(dǎo)的人肺上皮細(xì)胞焦亡[8]。另外，RSV能夠通過(guò)調(diào)控miR-223p/NLRP3信號(hào)減少皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞炎癥性死亡，從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用[9]。但是，目前有關(guān)RSV對(duì)NEC細(xì)胞焦亡的影響及其作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建NEC新生小鼠模型，探究RSV對(duì)NEC細(xì)胞焦亡的影響及其可能的作用機(jī)制，進(jìn)而為臨床治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 選取SPF級(jí)，5日齡C57BL/6新生小鼠，體質(zhì)量為(4.35±0.25)g , 湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK(湘)2018-0001。

1.1.2試劑與儀器 白藜蘆醇(深圳匯鑫榮生物有限公司，純度≥99%，批號(hào)：090226)；配方奶粉(Abbott Laboratories，美國(guó))；LPS(Sigma公司，美國(guó))；多聚甲醛(碧云天生物技術(shù)有限公司，上海)；蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，上海)；caspase-1抗體(武漢三鷹，批號(hào)：22915-1-AP)；GSDMD抗體(武漢三鷹，批號(hào)20770-1-AP)；IL-1β抗體(Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：12507)；IL-18抗體(Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：54943)；β-actin(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：AF5001)；山羊抗小鼠IgG二抗(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：A0412)；山羊抗兔IgG二抗(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：A0408)；Western blot一抗、二抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0018FS)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C0105S)；小鼠IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：PI301)；小鼠IL-18 ELISA檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：PI553)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定試劑盒(TAKARA，美國(guó))。單功能酶標(biāo)儀(湖南湘儀技術(shù)有限公司)；低溫、高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)；細(xì)胞組織碾磨儀(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)；Western blot檢測(cè)裝置(美國(guó)Bio-Rad伯樂(lè)公司)；熒光倒置顯微鏡(日本/奧林巴斯Olympus)；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥干預(yù) 將5日齡的新生C57BL/6小鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、壞死性小腸結(jié)腸炎模型組(NEC)以及RSV藥物干預(yù)組(RSV)，每組小鼠各10只。NEC組小鼠：置于保溫箱內(nèi)，人工喂養(yǎng)，按照參考文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行配方奶粉喂養(yǎng)，每天4次，每次50 μL·g-1，并將小鼠置于100%氮?dú)馊毖跸渲校毖?0 s，隨后置于4 ℃冰箱中，冷刺激10 min，每日10 ∶00、14 ∶00、22 ∶00分別行1次缺氧冷刺激，連續(xù)3 d；在小鼠出生后6 d和7 d分別給予3 mg·kg-1的的LPS灌胃，雙盲法行腸組織病理評(píng)分分值≥2分，認(rèn)為成功構(gòu)建NEC小鼠模型。RSV藥物干預(yù)組小鼠于6-11 d，每日1次，每次給予RSV(將RSV溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉中濃度為0.1 mg·g-1)灌胃處理，于12 d處死小鼠，期間小鼠記錄造模前后的體質(zhì)量，解剖留取小鼠小腸末端回腸組織進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2各組新生小鼠一般情況觀察 觀察各組新生小鼠的活動(dòng)以及胃腸反應(yīng)狀況并記錄小鼠體質(zhì)量。

1.2.3各組小鼠腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察 各組小鼠于處理d 12時(shí)處死，取回腸組織，肉眼觀察小鼠腸組織腸腔內(nèi)積氣，出血情況、壞死以及形態(tài)串珠樣改變等。取小鼠回腸組織1-2 cm，采用4%的多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，再用不同濃度的乙醇溶液梯度脫水，然后用二甲苯進(jìn)行組織透明，最后經(jīng)石蠟包埋，切片，染色。步驟根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行HE染色操作，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠回腸組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

1.2.4腸組織IL-1β、IL-18含量測(cè)定 收集各組小鼠腸組織，按照組織質(zhì)量 ∶裂解液體積比=1 ∶5，裂解組織，4 ℃、12 000×g離心15 min并收集各組上清液按照江蘇碧云天公司提供的IL-1β和IL-18試劑盒進(jìn)行各自濃度測(cè)定。

1.2.5Western blot檢測(cè)腸組織caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18表達(dá) 取各組大鼠腸組織，PBS潤(rùn)洗1-2次，離心，按照腸組織碾磨體積 ∶加入細(xì)胞組織裂解液體積=1 ∶5，冰上裂解1 h；4 ℃、12 000×g離心15 min，收集上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量檢測(cè)；然后取各組大鼠腸組織總蛋白30 μg，上樣至聚丙烯酰胺80 V凝膠電泳，80 V電泳30 min后，轉(zhuǎn)120 V、電泳60 min，至溴酚藍(lán)指示電泳至凝膠最底層。依據(jù)蛋白質(zhì)指示marker和目的蛋白分子量大小進(jìn)行，切取目的膠條，采用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)長(zhǎng)2 h。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育caspase-1抗體(1 ∶1 000)，GSDMD抗體(1 ∶1 000)，IL-1β抗體(1 ∶500)、IL-18抗體(1 ∶500)以及β-actin抗體(1 ∶2 000)，4 ℃過(guò)夜，孵育對(duì)應(yīng)的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗((1 ∶5 000)1-2 h，；搖床搖晃上加TPBS洗滌3次，5 min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腸組織miR-223表達(dá) 依據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟提取小鼠腸組織總RNA，并運(yùn)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度與純度。以RNA為模板，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。再以cDNA為模板，根據(jù)廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：92 ℃，30 s；92 ℃，5 s；60 ℃，31 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。采用7300 System SDS Software 分析數(shù)據(jù)，根據(jù)2-△△Ct值相對(duì)定量樣本中目的基因表達(dá)水平。其中miR-223：F:5′-GGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′，R:5′-CGGTCGTGTCAGTTTGTCAA-3′；U6：F:5′-CCTCACTGTCCACCTTCCA-3′，R:5′-GGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′。

2 結(jié)果

2.1 各組新生小鼠一般情況比較Control組新生小鼠生長(zhǎng)發(fā)育正常，未出現(xiàn)胃腸道癥狀，體質(zhì)量逐漸增加。NEC組新生小鼠于造模后3 d出現(xiàn)腹脹、腹瀉、稀便等癥狀，發(fā)育遲緩，體質(zhì)量降低(P<0.01)。RSV干預(yù)組新生小鼠體質(zhì)量增加(P<0.05)(Tab 1)，腹脹、腹瀉、稀便等癥狀減輕。

Tab 1 Changes in body mass of each group of newborn mice before and after modeling n=6)

2.2 各組新生小鼠腸道組織大體及病理變化大體觀察顯示，Control組小鼠腸組織呈現(xiàn)淡黃色、部分出血樣改變、腸道無(wú)脹氣。NEC組小鼠可見(jiàn)腸道明顯損傷，腸道脹氣明顯，腸壁變薄，易破損，呈現(xiàn)串珠樣改變。RSV干預(yù)組小鼠腸組織大部分呈現(xiàn)淡黃色，彈性尚可，腸道有輕度脹氣，有輕度串珠樣變化。病理組織切片顯示，Control組小鼠腸組織結(jié)構(gòu)清晰正常，腸道絨毛高聳以及上皮完整，黏膜層、黏膜下層和固有層無(wú)斷裂，充血水腫現(xiàn)象；NEC組小鼠腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，壞死嚴(yán)重，絨毛變性明顯部分脫落并伴有水腫，肌層變薄，斷裂等；RSV組小鼠腸組織損傷明顯減輕，形態(tài)結(jié)構(gòu)排列相對(duì)規(guī)則，絨毛層次不齊，水腫現(xiàn)象減輕，黏膜層、黏膜下層和固有層未見(jiàn)明顯分離(Fig 1)。

Fig 1 Observation of gross and pathological morphology of intestinal tissues of newborn mice in each group (×200)

2.3 RSV對(duì)NEC小鼠細(xì)胞焦亡的影響與Control組相比，NEC組小鼠腸組織cleaved-caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，caspase-1和GSDMD-N表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NEC組相比，RSV干預(yù)組小鼠腸組織cleaved-caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，caspase-1和GSDMD-N表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(Fig 2)。ELISA檢測(cè)與Control組相比，NEC組小鼠腸組織IL-1β和IL-18含量增加(P<0.01)；與NEC組小鼠相比，RSV組小鼠腸組織IL-1β和IL-18含量降低(P<0.05)(Fig 3)。

2.4 RSV對(duì)NEC小鼠miR-223表達(dá)的影響與Control組相比，NEC組小鼠腸組織miR-223表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；與NEC組相比，RSV組小鼠腸組織miR-223表達(dá)上調(diào)(P<0.01)(Fig 4)。

Fig 2 Effect of RSV on pyroptosis of intestinal tissue cells in newborn mice n=6)

Fig 3 Effect of RSV on content of IL-1β and IL-18 in intestinal tissues of newborn mice n=6)

Fig 4 Effect of RSV on expression of miR-223 in intestinal tissues of newborn mice n=6)

3 討論

NEC是由多種因素導(dǎo)致的腸道屏障弱化，炎癥反應(yīng)加劇，上皮損傷并形成惡性循環(huán)的一種嚴(yán)重危害早產(chǎn)兒生命健康的獲得性胃腸疾病，但是其發(fā)病原因尚不清楚。目前，廣泛性研究認(rèn)為缺血缺氧、感染、腸道菌群的失衡等是誘發(fā)NEC的重要因素。新近研究表明，炎癥反應(yīng)的失衡亦是導(dǎo)致NEC腸道損傷的重要原因，過(guò)度的炎癥因子釋放導(dǎo)致組織和細(xì)胞的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，加重NEC的進(jìn)程[11]。IL-1β能夠通過(guò)募集、激活免疫細(xì)胞，誘發(fā)炎癥介質(zhì)釋放并介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，最終誘導(dǎo)NEC腸道損傷[12]。另外，TNF-α亦可以通過(guò)誘導(dǎo)小鼠小腸上皮細(xì)胞凋亡和炎癥性死亡誘導(dǎo)小鼠腸黏膜損傷[13]。以上研究表明，炎癥在NEC疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。因此，明確NEC炎癥的發(fā)生機(jī)制對(duì)改善和治療NEC尤為關(guān)鍵。細(xì)胞焦亡作為一種新的炎癥性細(xì)胞死亡方式，在心血管、腫瘤、呼吸以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病均得到深入研究。組織和細(xì)胞產(chǎn)生適度焦亡反應(yīng)可以維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，一旦細(xì)胞焦亡失衡會(huì)誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，加重組織和細(xì)胞損傷。對(duì)此，本研究首先通過(guò)構(gòu)建NEC新生小鼠模型，探究細(xì)胞焦亡與NEC的關(guān)系。結(jié)果顯示，與Control組相比，NEC組小鼠大體觀察可見(jiàn)腸道明顯損傷，腸道脹氣明顯，腸壁變薄，易破損，呈現(xiàn)串珠樣改變；病理組織切片顯示，腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，壞死嚴(yán)重，絨毛變性明顯部分脫落并伴有水腫，肌層變薄，斷裂等，表明NEC小鼠模型建立成功。進(jìn)一步通過(guò)Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，NEC組小鼠腸組織cleaved-caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)上調(diào)，IL-1β和IL-18含量增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明細(xì)胞焦亡參與了NEC小鼠腸道損傷。RSV具有典型抗炎活性作用，其能夠通過(guò)抑制炎癥因子釋放，緩解多種細(xì)胞焦亡。與NEC組相比，RSV組小鼠腸組織cleaved-caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)下調(diào)，IL-1β和IL-18含量降低，說(shuō)明RSV能夠通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡，緩解NEC小鼠腸道損傷。那么有關(guān)RSV對(duì)NEC小鼠細(xì)胞焦亡的調(diào)控機(jī)制又是如何呢？

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)約20-24 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，它可通過(guò)與靶基因3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而降低靶基因的表達(dá)水平，參與調(diào)控多種基因表達(dá)。既往研究證實(shí)miRNA與NEC密切相關(guān)。miR-223位于X染色體q12位點(diǎn)，表達(dá)受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[14]。在一項(xiàng)隊(duì)列研究中證實(shí)43例NEC患者糞便中miR-223表達(dá)顯著高于非NEC患者[15]。另外，在對(duì)NEC患兒外周血白細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序顯示，與對(duì)照組相比，NEC組共有482個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中已知58個(gè)上調(diào)，68個(gè)下調(diào)，has-miR-223-5p表達(dá)與測(cè)序結(jié)果一致上調(diào)[16]。上述研究提示：miR-223可能是NEC的一種重要調(diào)控miRNA。研究發(fā)現(xiàn)miR-223-3p參與包括免疫系統(tǒng)-炎癥反應(yīng)、血管系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病等。但是有關(guān)miR-223在NEC中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)RT-PCR檢測(cè)各組新生小鼠腸組織miR-223表達(dá)水平，結(jié)果顯示與Control組相比，NEC組小鼠腸組織miR-223表達(dá)下調(diào)；與NEC組小鼠相比，RSV組小鼠腸組織miR-223表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果miR-223表達(dá)水平與以往研究不同可能是因?yàn)闄z測(cè)標(biāo)本的差異。既往文獻(xiàn)資料顯示，在LPS誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞焦亡中，miR-223表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-223能夠靶向NLRP3抑制LPS誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞焦亡[17]。另外，在大鼠細(xì)菌性腦膜炎模型中，RSV能夠上調(diào)miR-223，抑制NLRP3，進(jìn)而降低皮至神經(jīng)元細(xì)胞炎性死亡[9]。本研究結(jié)果表明，RSV能夠抑制NEC小鼠細(xì)胞焦亡，緩解小鼠腸道損傷，其可能與上調(diào)miR-223表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，RSV抑制NEC小鼠腸組織細(xì)胞焦亡，緩解NEC腸道損傷，其機(jī)制可能與上調(diào)miR-223表達(dá)相關(guān)。以上研究結(jié)果初步闡明了RSV在NEC中的作用，進(jìn)一步豐富了NEC小鼠細(xì)胞焦亡的發(fā)生機(jī)制，以其為NEC治療提供新的思路。但是有關(guān)miR-223是如何調(diào)控細(xì)胞焦亡尚不清楚。因此，在后續(xù)的研究中計(jì)劃將通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠小腸上皮細(xì)胞，探究過(guò)表達(dá)miR-223對(duì)LPS誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞焦亡的影響，進(jìn)而為RSV治療NEC提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。