MANF對結直腸癌Caco-2細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

陳 瀅,王 杰,趙 倩,倪倩倩,侯 超

(安徽醫科大學1.護理學院、2.基礎醫學院、3.第一附屬醫院新生兒科，安徽 合肥 230032； 4.中國科學技術大學附屬第一醫院產科，安徽 合肥 230032)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化系統惡性腫瘤，在男性和女性最常被診斷出的癌癥中分別位列第3位和第2位，也是全世界癌癥死亡的第2大主要原因[1]。隨著醫學研究的發展，結直腸癌的治療方法日趨多元化，外科切除配合放射、藥物療法、靶向治療等不同綜合治療方法不斷出現，但是患者預后仍未見顯著變化，并且隨著腫瘤耐藥機制的產生，藥物治療效果變差，新的治療方法亟待產生[2-3]。中腦新型膠質細胞源性神經營養因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)是一種內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)誘導的分泌性蛋白[4]，在多種ER應激相關疾病中具有保護作用[5-8]。MANF在炎癥刺激下入核，與p65的DNA結合結構域結合，抑制NF-κB通路，發揮抗炎作用[9]。近期研究發現，SUMO1可以促進MANF的核轉位，抑制NF-κB通路，發揮抑制肝癌的作用[10]。有研究表明NF-κB通路的激活也是結直腸癌的重要發病機制之一[11]，但目前尚無MANF在胃腸道腫瘤中相關作用的報道。故該實驗擬通過在結直腸癌細胞系Caco-2中過表達MANF來研究其對結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響，并探索可能的作用機制，為結直腸癌的治療提供新型藥物作用方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株及質粒 細胞系Caco-2細胞購自武漢Procell公司；pEGFP-C2-MANF質粒與pEGFP-C2質粒為安徽醫科大學沈玉先課題組惠贈；

1.1.2試劑 轉染試劑jetprim buffer購自法國保利嘉公司；DMEM培養基(美國HyClone,批號 AE29431646)；TRIzol(美國Ambion,批號 190903)SYBR Green(日本TOYOBO,批號 9283373)；MANF、caspase-3/cleaved caspase-3抗體(英國Abcam)；β-actin antibody、羊抗兔IgG-HRP(沈陽萬類生物)；ECL發光液(康為世紀， 批號 03782/60319)、CCK8試劑盒(南京Vazyme，批號 806051)；Matrigel膠(美國Corning，批號 0042321)；PE Annexin Ⅴ Apoptosis Detection Kit (美國BD，批號 9283373)；熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega)；重組人TNF-α(中國義翹神州)；上下游引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.3儀器 超凈工作臺(蘇州蘇潔醫療器械有限公司)；電泳儀(美國BIO-RAD)；凝膠成像系統(美國BIO-RAD)；流式細胞儀(美國BD)

1.2 方法

1.2.1MANF過表達Caco-2細胞系的建立與驗證 參照jetPRIME試劑說明書分別轉染GFP空載體和MANF-GFP質粒進入Caco-2細胞，1 d后通過熒光判斷轉染效率。分別提取MANF-GFP組和GFP組細胞總RNA，測定濃度后，進行逆轉錄得到相應的cDNA。取上述cDNA作為模板，上下游引物(MANF上游引物：5′-CGACTGCGAAGTTTGTATTT-3′，MANF下游引物：5′-GTGGCTGCATCATCTGTG-3′；β-actin上游引物：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，β-actin下游引物：5′-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′)、SYBR Green mastermix、H2O，按照說明書指示進行熒光定量，利用2-△△CT方法對結果進行分析。

1.2.2細胞遷移侵襲試驗 將Caco-2細胞分為NC組、GFP組和MANF-GFP組，NC組不進行轉染處理，GFP組和MANF-GFP組分別轉染GFP空載體質粒和MANF-GFP質粒。將轉染好的各組Caco-2細胞制成1×106個·mL-1濃度的細胞懸液。用稀釋好的基質膠涂布到上室膜上，預先包被。遷移實驗：下室內加入500 μL培養基，放入未包被的小室，加入100 μL細胞懸液；侵襲實驗：下室內加入500 μL培養基，放入包被的上室，加入100 μL細胞懸液。培養48 h后，分別計數底室Caco-2細胞數目。

1.2.3CCK-8檢測細胞增殖 將Caco-2細胞分為NC組、GFP組、MANF-GFP組接種于96孔培養板中，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后，測定OD值。

1.2.4免疫印跡實驗 提取細胞總蛋白，沸水浴10 min，分別測定GFP組與MANF-GFP組蛋白濃度。經過SDS-PAGE膠分離蛋白，轉印蛋白至硝酸纖維素膜，以BSA溶液封閉1 h，分別用MANF、caspase-3、β-actin抗體于4 ℃冰箱過夜，二抗在25 ℃條件下孵育2 h，顯影進行灰度分析。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 分別收集GFP組和MANF-GFP組Caco-2細胞。以1 000 r·min-1轉速離心沉淀細胞，PBS清洗，重復上述操作2遍。加入結合緩沖液，用移液器緩慢吹打，將Caco-2細胞制成懸液，吸取100 μL懸液到流式管中，分別添加5 μL的PE Annexin Ⅴ、Propidium Iodide和7-AAD，混勻后于暗處室溫孵育15 min。各管補加400 μL binding buffer, 混勻后在儀器上檢測。

1.2.6熒光素酶報告實驗 將細胞分為GFP組、MANF組、GFP+TNF-α組、MANF+ TNF-α組，按分組加入TNF-α(0.01 ng·L-1)刺激8 h。吸去培養液， PBS洗2遍，每組細胞加入200 μl的lysis solution，室溫裂解15 min后，收集裂解液作為樣品。分別測量樣品的Firefly和Renilla值，記錄熒光素酶的比值。

2 結果

2.1 外源性MANF在Caco-2細胞中成功表達收集MANF-GFP與空載體GFP轉染Caco-2細胞，分別提取RNA與總蛋白，用RT-PCR和Western blot方法檢測MANF mRNA和蛋白表達水平。結果顯示外源性MANF成功轉入Caco-2細胞(Fig 1)。

2.2 MANF具有抑制Caco-2細胞遷移、侵襲的能力Transwell Caco-2細胞遷移實驗結果如Fig 2A所示，與NC組比較，GFP組Caco-2細胞遷移能力沒有減弱；與GFP組比較，MANF-GFP組Caco-2細胞遷移能力明顯減弱(P<0.01)；Transwell Caco-2細胞侵襲實驗結果如Fig 2B所示，與NC組比較，GFP組Caco-2細胞侵襲能力差異無統計學意義；與GFP組比較，MANF-GFP組Caco-2細胞侵襲能力減弱(P<0.01)。結果表明在Caco-2細胞中過量表達MANF可有效下調細胞的遷移和侵襲能力。

Fig 2 Influence of MANF on Caco-2 cell migration

2.3 MANF具有抑制Caco-2細胞增殖的能力CCK-8細胞增殖檢測發現，MANF-GFP組(OD值=0.275±0.035)顯著低于GFP組(OD值=0.371±0.047)(P<0.01，Fig 3 )。結果表明細胞中過量表達MANF可以抑制Caco-2細胞的增殖。

2.4 MANF促進Caco-2細胞凋亡WB結果顯示，轉染MANF-GFP質粒可以提高Caco-2細胞中cleaved caspase-3蛋白的生成；flow cytometry實驗顯示，GFP組發生凋亡的Caco-2細胞比例(0.0273)，低于MANF-GFP組發生凋亡的Caco-2細胞比例(0.1884)(Fig 4 )。結果表明過表達MANF可以促進Caco-2細胞凋亡。

Fig 3 Influence of MANF on Caco-2 cell sensitivity detected

Fig 4 Influence of MANF on Caco-2 cell apoptosis

2.5 過表達MANF降低NF-κB轉錄活性NF-κB熒光素酶報告實驗顯示，空載體GFP組相對值(1.00±0.14)高于MANF組相對值(0.51±0.07)，差異具有統計學意義(P<0.01)。TNF-α刺激后，空載體GFP組相對值(1.66±0.17)，仍高于MANF組相對值(1.18±0.13)，差異具有統計學意義(P<0.05，Fig 5)。結果表明MANF可以有效抑制NF-κB信號通路的轉錄激活。

Fig 5 Influence of MANF on Caco-2 cell NF-κB

3 討論

結直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，近年來我國結直腸癌的發病率和死亡率不斷上升[12]。對于Ⅲ期結直腸癌患者普遍推薦手術后氟尿嘧啶、奧沙利鉑聯合化療，降低癌癥復發率，提高患者生存率[13]。但是幾乎所有結直腸癌患者都會出現耐藥性，導致抗癌藥物療效下降，尋找新的更為有效的結直腸癌輔助治療方法尤為重要[2]。

MANF是一個高度保守的可溶性蛋白，分子量約為18ku，ER應激可誘導其分泌[4]，MANF在多種ER應激相關疾病中具有保護作用[5-8]。目前關于MANF的研究大多集中在對缺血、缺氧的神經元細胞及心肌細胞的保護作用，在小鼠的心肌梗死模型中，給予外源重組MANF能減少組織損傷[5]；在慢性房顫患者中，MANF的下調可導致更多的心房細胞凋亡[14]；MANF可通過抑制ER應激和激活PI3K/Akt/mTOR通路對黑質紋狀體多巴胺能系統發揮長期的神經保護和神經再生功能[7]；MANF可通過抑制自噬，明顯改善6-羥多巴胺誘導的神經毒性作用[8]；MANF可改善腦缺血大鼠的行為，減少神經元的死亡，并減少大鼠腦梗塞面積[15]。近年來，有研究關注到MANF與腫瘤的關系，發現與鄰近的非癌組織相比，肝細胞癌(HCC)組織中的MANF mRNA和蛋白水平較低。MANF表達水平高的患者比低水平的患者具有更好的生存率。體外實驗表明MANF抑制了肝癌細胞的遷移和侵襲，肝細胞特異性缺失MANF會加速N-亞硝基二乙胺(DEN)誘導的HCC，提示MANF可能是抑癌因子[10]。本實驗在Caco-2細胞中過表達MANF，通過CCK8試驗、Transwell試驗、免疫印跡試驗、流式細胞試驗，發現MANF可以抑制Caco-2細胞的增殖、遷移、侵襲的能力，并促進細胞凋亡，提示MANF具有抑制Caco2細胞生物學功能的影響。

NF-κB蛋白家族，又名Rel蛋白家族，是由一系列名為NF-κB1(p50)，NF-κB2(p52)，RelA(p65)，RelB和c-Rel的蛋白分子組成。基本的NF-κB信號通路過程為IκB蛋白通過遮蓋RelA、RelB和c-Rel的核轉移序列來阻止其入核與DNA結合。IκB激酶復合物IKK可被胞外刺激信號(如：TNF-α、LPS等)激活，使IκB磷酸化，繼而通過泛素蛋白酶體途徑降解，導致NF-κB的核定位序列暴露，NF-κB直接入核并結合DNA，調控多種細胞因子和抗凋亡基因[16]。NF-κB通路可以促進腫瘤細胞遷移、侵襲和轉移，抑制腫瘤細胞的凋亡，是結直腸癌的重要發病機制之一[11]。研究表明，當轉錄因子NF-κB被激活，細胞中抗凋亡、促增殖以及免疫相關的基因就會表達上調[17]。結腸癌組織大量浸潤T細胞產生大量Th17相關細胞因子，TNF-α和IL-6，激活NF-κB促進結腸癌細胞增殖[18]。MANF具有抑制NF-κB通路的作用[9-10]。在兔關節炎模型發現MANF在炎性增厚的滑膜組織表達增多，并且MANF能在炎癥的誘導下由胞質向胞核轉運，在神經細胞中也觀察到同樣現象。MANF入核后與p65的DNA結合結構域結合，抑制NF-κB通路，發揮抗炎作用[9]。深入研究MANF的入核機制發現：SUMO1可以促進MANF的核轉位，增強MANF與p65的相互作用[10]。本研究用熒光素酶報告基因實驗證明，在Caco-2細胞中，與對照組相比，MANF可以顯著抑制NF-κB信號通路，提示MANF可能是通過調控NF-κB通路，從而發揮其抑癌基因的作用。但MANF在結直腸癌中具體通過何種機制調控NF-κB，有待進一步研究。

綜上所述，本研究發現MANF可以抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲的能力，并促進其細胞凋亡，可能通過抑制NF-κB信號通路發揮抗腫瘤作用，有望成為治療結直腸癌的新靶點。