當歸-川芎藥對對腦缺血/再灌注損傷大鼠JAK-STAT信號通路的影響

泥文娟，張書琦，王曉艷,3，賈文匯，張明亮，李 琨，唐進法,,3，李偉霞,,3

(河南中醫藥大學 1.藥學院、2. 第一附屬醫院中藥臨床評價技術河南省工程實驗室、 3. 呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心，河南 鄭州 450046)

腦中風(也稱腦卒中)因其高發病率、高致殘率、高死亡率的特點，已成為危害人類健康的重大疾病，且近年來呈現發病率上升，發病年齡提前的趨勢[1]。缺血性中風在腦中風中占比較大，對急性期的有效治療是降低腦中風患者向后遺癥期發展的關鍵。現有臨床證據表明，與西醫治療相比，中醫藥在腦中風的整體治療中具有獨特優勢。中醫理論認為，從瘀論治缺血性中風是基本療法[2]。研究表明，理血類活血藥對當歸-川芎是缺血性中風的核心藥味和藥對[3]。當歸能補血活血，川芎能行氣散血，二藥相使配對可活血、養血、行氣三者并舉，使祛瘀而不耗傷氣血，養血而不致血壅氣滯。當歸-川芎配伍不僅是臨床常用經典活血化瘀藥對(佛手散、芎歸散、芎湯、中成藥舒腦欣滴丸等)，還是治療缺血性中風的經典方藥補陽還五湯和腦心通膠囊等的重要組成。

Janus激酶/信號轉導子及轉錄激活子(Janus kinase-sinal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)作為人體重要的細胞內信號轉導通路，它的缺陷和異常活化與多種疾病的發生發展及預后的關系正日益受到人們的關注。有研究表明，該通路的激活與腦缺血/再灌注(I/R)損傷的病理生理過程密切相關[4]，但當歸-川芎藥對如何通過調節JAK/STAT通路家族成員或上下游因子的表達，產生相應的生物學效應，進而發揮腦保護作用的具體機制尚不清楚。故本研究采用線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)致I/R損傷動物模型，觀察當歸-川芎藥對的活血化瘀和腦保護作用，并探討其對JAK-STAT信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級健康♀ ，SD大鼠，體質量(220±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0006。

1.2 藥物與試劑當歸(批號18110101)，購自鄭州瑞龍制藥股份有限公司；川芎(批號171229)，購自安徽石田中藥飲片有限公司，經河南中醫藥大學第一附屬醫院藥學部陳天朝主任藥師鑒定，符合2015版《中國藥典》一部相關規定。尼莫地平片(批號BJ43395)，購自拜耳醫藥保健有限公司；2%TTC染色液(批號20190723)購于北京索萊寶科技有限公司；甲醛溶液(批號20190101)購于煙臺市雙雙化工有限公司；大鼠核因子κB(NF-κB)、血管內皮生長因子(VEGF)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)ELISA試劑盒均購自上海茁彩生物科技有限公司(批號0711E19)；丙二醛(MDA)測試盒(批號20191006)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(批號20190930)、谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-Px)測試盒(批號20190927)和總蛋白定量(考馬斯亮藍法)測試盒(批號20190726)均購自南京建成生物工程研究所；兔抗ERK1/2(批號00077469)、兔抗JAK2(批號00046735)、兔抗AKT(批號00077916)購自Proteintech中國公司；兔抗p-STAT3購自Cell Signaling Teachnology公司；SP9000試劑盒和DAB試劑盒購自北京中杉生物工程有限公司。

1.3 儀器Neofuge 1600R型臺式低溫高速離心機(上海力申科學儀器股份有限公司)；S10型手提式高速分離器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；元素型18120 Molecular(摩爾)超純水系統(上海摩勒科學儀器有限公司)；SHP-250型生化培養箱(上海森信實驗儀器有限公司)；BS224S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；L3200型線栓(廣州佳靈生物技術有限公司)；DHG-9031型電熱恒溫水浴箱(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.4 藥物的制備取當歸和川芎藥材各1 kg混合，加10倍量體積的50%乙醇冷凝回流提取3次，每次2 h，將3次濾液合并，減壓濃縮至稠浸膏，稱重為1 340 g，計算得到當歸-川芎藥對的生藥量為1.49 g生藥/g浸膏。

1.5 大鼠腦缺血/再灌注模型的制備參照Zea Longa的線栓法[5]加以改良制備大鼠MCAO致腦缺血-再灌注(I/R)損傷動物模型，大鼠禁食12 h后，經腹腔注射10%水合氯醛(0. 35 mL/100 g)進行麻醉，仰臥位固定在鼠板上，75%酒精消毒大鼠頸部手術區域，沿頸部正中縱向切口，切開皮膚后鈍性分離組織，暴露右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，完全剝離血管表面迷走神經。結扎CCA近心端和ECA，用動脈夾暫時夾閉CCA遠心端，在距動脈分叉處3 mm的CCA上剪一小口，將線栓有硅膠的一端從小口插入，松開動脈夾，快速將線栓經過動脈分叉處繼續送入ICA，當線栓上的黑點接近動脈分叉處時減緩進線栓的速率，感到輕微阻力時停止插入。結扎固定CCA與線栓，在切口處給予青霉素預防感染，縫合切口，將線栓尾端留在皮膚外。將大鼠放在電熱毯上，缺血2 h后輕輕拔出線栓再灌注24 h。

1.6 動物分組及給藥將90只大鼠隨機分為：假手術組(sham)、模型組(I/R)、GX低劑量組(GXL, 4.86 g·kg-1)、GX中劑量組(GXM, 8.10 g·kg-1)、GX高劑量組(GXH, 11.34 g·kg-1)和尼莫地平片對照組(Nimodiping，15 mg·kg-1)，每組15只。給藥組大鼠每天灌胃給藥1次，連續給藥7 d。于d 6晚上將大鼠禁食不禁水飼養，d 7按照模型制備方法造模。假手術組和模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水。動物給藥劑量按體表面積換算系數計算：人臨床用量×0.018/200×1 000×臨床等效量的倍數，當歸-川芎藥對的低、中、高劑量組分別為臨床等效量的3、5和7倍。

1.7 標本采集及指標檢測

1.7.1神經功能評分 大鼠再灌注24 h后，采用Longa五分制評分法進行神經功能評分[5]：正常行走，無神經功能缺損，0分；垂直提起時左前爪無力或未完全伸直，輕度局灶性神經功能缺損，1分；行走時轉到對側即左轉，中度局灶性神經功能缺損，2分；行走時向左側跌倒，嚴重局灶性神經功能缺損，3分；不能自主行走，意識低下，4分。

1.7.2腦梗死體積測定 每組大鼠取5只用10%水合氯醛進行麻醉后，使用普通采血管進行腹主動脈取血，取血后迅速斷頭取出完整腦組織，在-20 ℃冰箱中冷凍30 min，進行2 mm連續冠狀切片，放于2% TTC染液中，在37 ℃生化培養箱中避光染色30 min，每5 min翻面一次。腦組織染色結束后拍照記錄，其中白色部分為梗死區域，紅色部分為正常區域。

1.7.3腦組織病理學檢測 每組中另外10只大鼠用10%水合氯醛進行麻醉后，使用普通采血管進行腹主動脈取血，取血后迅速斷頭取腦組織，切取前半部分用于生化指標含量測定，后半部分置于4%多聚甲醛中固定過夜。石蠟包埋，進行2 μm切片，采用H&E染色法對腦組織進行染色，并在顯微鏡下觀察腦半暗帶區病理改變。

1.7.4生化指標測定 將大鼠大腦前半部分按質量 ∶體積=1 ∶9加入預冷的生理鹽水，于冰上使用高速分離器制成腦組織勻漿，采用ELISA法對腦組織勻漿中NF-κB、VEGF、VACM-1、ICAM-1、PAI-1的表達水平進行檢測；采用生化法對腦組織勻漿中MDA、SOD和GSH-Px的表達水平進行檢測。所有試劑盒均按照說明書進行操作。

1.7.5免疫組化檢測 將腦組織切片脫蠟，檸檬酸抗原修復，3% H2O2封閉內源性過氧化物酶，加山羊血清并室溫封閉內源性生物素，分別滴加兔抗大鼠一抗(JAK2、p-STAT3、AKT、ERK1/2)、抗兔二抗、辣根酶標記卵霉鏈白素，依次進行DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用日本尼康顯微照像系統選取視野進行圖像采集。

2 結果

2.1 神經功能評分假手術組大鼠無神經功能損傷癥狀。模型組大鼠(n=12)中3只輕度神經功能缺損，6只中度神經功能缺損，3只嚴重神經功能缺損；陽性給藥組大鼠(n=13)中3只無神經功能缺損，5只輕度神經功能缺損，3只中度神經功能缺損，1只嚴重神經功能缺損；GXL組大鼠(n=14)中4只無神經功能缺損，3只輕度神經功能缺損，5只中度神經功能缺損，3只嚴重神經功能缺損；GXM組大鼠(n=10)中1只無神經功能缺損，8只輕度神經功能缺損，1只嚴重神經功能缺損；GXH組大鼠(n=10)中4只無神經功能缺損，3只輕度神經功能缺損，2只中度神經功能缺損，1只嚴重神經功能缺損(Fig 1)。結果表明，當歸-川芎藥對低、中和高劑量給藥組及陽性藥尼莫地平均能顯著改善I/R損傷大鼠的神經功能缺損癥狀。

Fig 1 Neurological function score results of each group

2.2 腦梗死體積測定假手術組大鼠腦組織染色均勻，無梗死區域。模型組和各給藥組大鼠腦組織易碎，均可見白色的梗死區域，且與紅色的正常腦組織之間界限不明顯(Fig 2)。

2.3 腦組織病理學檢測假手術組大鼠腦組織半暗帶區結構清晰，排列緊密整齊，神經細胞形態完全正常，胞核居中，未見空泡樣改變。模型組大鼠腦組織半暗帶區出現壞死、水腫、炎癥、神經細胞排列紊亂、細胞異常增大、出現空泡樣改變、神經元數量減少等病理特征。與模型組比較，當歸-川芎藥對給藥組和尼莫地平組均對腦組織病理狀態有一定改善作用，其中，GXH、GXM組和尼莫地平片組的改善作用最強，能有效改善水腫、炎癥神經細胞空泡變性和組織紊亂等病理狀態(Fig 3)。

Fig 2 Results of TCC staining

Fig 3 HE staining of penumbra of rat brain tissues (×40)

2.4 生化指標測定與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中MDA、NF-κB、VEGF、PAI-1和ICAM-1表達水平明顯升高(P<0.05)，GSH-Px和SOD表達水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，當歸-川芎藥對給藥組能明顯下調腦缺血/再灌注大鼠腦組織中MDA、NF-κB、VEGF、PAI-1和ICAM-1的水平(P<0.05)，上調GSH-Px和SOD表達水平(P<0.05),見Tab 1。

2.5 腦組織免疫組織化學檢測假手術組大鼠腦組織半暗帶區的JAK2和AKT主要表達于細胞質中，p-STAT3和ERK1/2表達于細胞核中(Fig 5)。與假手術組比較，模型組大鼠腦組織半暗帶區的JAK2和p-STAT3表達量均明顯升高，AKT表達量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，當歸-川芎藥對各給藥組的JAK2和p-STAT3表達量明顯降低，AKT和ERK1/2表達量明顯升高(P<0.05)。見Fig 4。

3 討論

臨床上缺血性腦中風多為半側大腦出現梗死，局灶性I/R模型更符合缺血性腦血管病的特點。I/R引起的損傷主要由兩個方面造成，一是缺血導致的損傷，二是血液恢復供應引起的繼發損傷，故I/R模型是目前研究藥物對缺血性腦血管病治療作用的常用動物模型[6]。尼莫地平是第二代二氫吡啶Ca2+通道拮抗劑，具有親脂性，可通過血腦屏障進入中樞神經系統，顯著減少腦梗死體積和神經元凋亡，使短暫性局灶性腦缺血的損傷降低33%，是目前腦血管疾病治療的首選藥物，已成為公認的神經保護藥物，故本研究選用該藥物作為陽性對照藥[7]。

課題組前期通過臨床數據挖掘發現，當歸-川芎藥對1 ∶1配比在腦病科中最為常用[8]；且實驗研究發現，當歸-川芎藥對1 ∶1醇提物的總活血效應優于水提和先水提后醇提給藥組，而醇提物中芳香酸類和苯酞內酯類成分的含量在相同配比中高于先水提后醇提物及水提物組[9]。故本研究選用當歸-川芎藥對1 ∶1醇提物來探索其對I/R大鼠的活血化瘀和腦保護作用。結果發現當歸-川芎藥對及陽性藥尼莫地平均可明顯改善I/R損傷大鼠的神經功能缺損癥狀，降低腦梗死面積，改善水腫、炎癥神經細胞空泡變性和組織紊亂等病理狀態。

JAK-STAT信號通路是近年來發現的一條與神經細胞增殖、分化、凋亡、細胞信號傳導相關的通路，與I/R發生發展密切相關。研究表明[10]，缺血后腦組織中JAK2和STAT3陽性表達均上調，并激活JAK2-STAT3磷酸化，使p-JAK2和p-STAT3蛋白表達明顯增加，誘導腦損傷，出現腦水腫、梗死面積擴大、神經功能障礙等現象；而下調JAK2/STAT3信號通路可減少缺血性腦梗死，恢復血腦屏障的完整性，促進I/R損傷后神經系統的恢復[11]。本研究結果發現，當歸-川芎藥對組大鼠腦組織缺血半暗帶區細胞中JAK2和p-STAT3表達水平較模型組均明顯降低，AKT和ERK1/2表達水平明顯升高，表明當歸-川芎藥對可通過抑制JAK/STAT信號通路發揮對大鼠I/R損傷的保護作用。

缺血性中風急性期可快速激活免疫炎癥反應，引起繼發性腦損傷，炎癥是I/R損傷的關鍵驅動因素[12]，NF-κB信號通路是炎癥調控中樞，與多種關鍵炎癥因子如細胞因子類(TNF-α、IL-6)、黏附分子類(VCAM-1、ICAM-1)等的表達有關，且血管黏附分子VCAM-1和ICAM-1水平是心腦血管疾病病變炎癥和活血效應的重要評價指標[13]。本研究結果表明，當歸-川芎藥對可明顯降低I/R損傷大鼠腦組織中NF-κB和ICAM-1水平，但劑量依賴性不強，提示抗炎是當歸-川芎藥對改善I/R損傷的機制之一。

Tab 1 Effects of GX on biochemical indexes of brain tissue in rats n=10)

Fig 4 Immunohistochemical results of JAK2, p-STAT3, AKT, ERK1/2 in penumbra and mean optical density of rat brain tissues (×40,

氧化應激是I/R過程中導致神經元損傷的關鍵機制之一，MDA是氧化應激的特異性標志物，SOD是機體內重要的抗氧化酶，GSH-Px可清除體內的脂類氫過氧化物，三者均是氧化應激過程中重要檢測指標[14]。本文研究結果顯示，當歸-川芎藥對組大鼠腦組織中MDA水平較模型組明顯降低，而GSH-Px和SOD水平明顯升高，說明抗氧化亦是當歸-川芎藥對保護腦組織的機制之一。

PAI是由血管內皮細胞合成和釋放的活性物質，是纖溶酶原激活物的生理性抑制劑，其在機體內含量越高，則形成血栓的可能性就越高，危險系數也會越高[15]。本研究結果發現，當歸-川芎藥對可明顯降低模型組大鼠腦組織中PAI-1水平。VEGF是目前已知的作用最強、特異性最高的血管生長因子，參與血管再生、神經保護及缺血后神經元再生，保護腦損傷[16]。在本研究中，當歸-川芎藥對組大鼠腦組織中VEGF并未表現出促進作用，可能因本實驗為I/R急性期。有研究顯示，治療腦梗塞的藥物早期能改善腦功能部分原因可能是減輕了腦梗死、腦水腫及其對周圍組織的壓迫作用，而不是由于神經細胞增殖代償，因為神經細胞發揮增殖、遷移，且進一步與全腦進行功能整合至少應該在恢復期[17]。

綜上，本文研究結果顯示當歸-川芎藥對可改善I/R損傷大鼠神經功能缺損、降低腦梗死面積、改善炎性水腫等作用，其機制與調控JAK-STAT信號通路及抗炎、抗氧化、保護神經等有關，為深入探究當歸-川芎藥對的活血化瘀及腦保護作用提供了重要參考。