mir-375調節notch通路對高氧誘導新生鼠肺上皮細胞凋亡的影響研究

黃潤英 范智利 肖吉群 鄭巍 蔡強

支氣管肺發育不良(bronchopulm onary dysplasi，BPD)是早產兒常見并發癥之一，發病機制復雜，其中高氧致肺損傷是主要原因，患兒肺發育不全且長時間處于高氧環境中易出現損傷[1]。而目前大多數學者認為氧化應激是肺損傷的主要原因，而細胞凋亡成為氧化應激引起肺損傷的主要機制之一[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)在疾病發生發展中參與氧化應激、炎性反應等過程，其中mir-375與氧化應激關系密切，其水平變化與疾病關系密切[3]；在腫瘤疾病中mir-375是凋亡腫瘤細胞衍生出的miRNA，高表達的mir-375可在凋亡過程中以非外泌體形式釋放出來，亦是吞噬細胞浸潤以及促進腫瘤微環境發展的關鍵調節劑[4]，但在BPD中筆者尚未發現研究。notch通路可決定肺泡上皮細胞的分化方向，參與高氧肺損傷修復過程，是一種保護性應激反應[5]。且mir-375與notch1在細胞增殖、遷移、侵襲、分化中都關系密切[6]，但未發現二者在細胞凋亡中的相關研究。本研究構建BPD模型，觀察mir-375對BPD大鼠肺上皮細胞凋亡的影響并探討其機制，為靶位點治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:健康SD孕鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SYXK(京)-2017-0033，清潔級，足月順產同一批新生SD大鼠作為研究對象，雄雌不限。所有實驗經醫院動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2 試劑與儀器:mir-375拮抗劑陰性對照、mir-375拮抗劑均購自廣州銳博生物科技有限公司。mir-375、U6引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；蘇木素-伊紅(hematoxylin-easine,HE)染色試劑盒、一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司，貨號：C0105、C1088、S0131S、S0060；一抗兔抗notch1、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl2)、Bcl2相關X蛋白(Bcl2 associated X protein，Bax)、GAPDH均購自英國abcam公司，貨號：ab52627、ab216985、ab59348、ab181602。氧箱購自美國Shellab公司；實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀購自美國ABI公司，型號：ABI Veriti 96孔；蛋白凝膠成像儀購自上海Tanon公司，型號：Tanon-4800。

1.2 方法

1.2.1 動物造模:參照文獻中方法[7]建立BPD模型。將80只出生后3 d大鼠隨機分為對照組、模型組、mir-375陰性對照組和mir-375拮抗劑組，每組20只。除對照組外，其他3組置于氧箱中，氧濃度維持在(70±5)%，同時吸收氧箱二氧化碳和水蒸氣保持氧箱中壓力恒定，對照組置于空氣中正常飼養，24 h后mir-375陰性對照組注射2 μl(濃度為0.5 μg/μl)mir-375拮抗劑陰性對照和納米轉染復合物的混合物；mir-375拮抗劑組注射2 μl(濃度為0.5 μg/μl)mir-375拮抗劑和納米轉染復合物的混合物；對照組和模型組注射2 μl無菌0.9%氯化鈉溶液，大鼠建模7 d和14 d分別每組取10只進行下列實驗。

1.2.2 體重變化:腹腔注射麻醉大鼠稱量體重。

1.2.3 qRT-PCR檢測大鼠肺組織中mir-375水平:稱重結束后立即處死大鼠，打開腹腔，部分肺組織置于4%多聚甲醛中做HE染色和免疫組化實驗，部分肺組織置于-80℃冰箱做qRT-PCR和蛋白免疫印跡(western blot，WB)實驗。-80℃冰箱取50 mg肺組織，RNA提取試劑盒提取肺組織總RNA，cDNA合成第一條鏈試劑盒合成cDNA，qRT-PCR儀對mir-375、內參U6擴增。引物序列：mir-375 F：5’-GGGTTTGTTCGTTCGGCTC-3’、R ：5’-CAGTGCGTGTAGTGGAG-3’；U6 F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’、R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。上樣體系20 μl：cDNA 1 μl(50 ng/μl)，F/R(10 μm)(0.5/0.5)μl，2×Mix 10 μl，ddH2O 8.0 μl。反應條件：95℃、10 min；95℃、15 s，62℃、60 s，40個循環。2-ΔΔCT法計算肺組織中mir-375表達水平。

1.2.4 HE染色觀察肺組織形態學:固定于4%多聚甲醛中的肺組織24 h后經不同濃度乙醇中脫水，二甲苯中透明，石蠟中包埋、冷凍凝固后切片。切片制作完成后經脫蠟、復水、染色，再脫水、透明、封片完成HE染色，光學顯微鏡拍照。

1.2.5 TUNEL檢測肺組織凋亡情況:1.2.4切片按TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒方法檢測凋亡情況，顯微鏡下TUNEL染色可見凋亡肺泡上皮細胞顯示綠色，正常肺泡上皮細胞細胞核DAPI染色顯示藍色，顯微鏡下觀察并計數。TUNEL染色陽性細胞百分比作為凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.6 免疫組化檢測大鼠肺組織中notch1表達水平:1.2.4切片并HE染色相同方法脫蠟、復水，滴加過氧化氫滅活內源性過氧化氫酶，熱修復抗原并加磷酸緩沖液沖洗，5%脫脂奶粉封閉20 min，滴加一抗notch1(1∶100)(陰性對照用同型同種鼠IgG代替一抗)2 h，滴加二抗20 min后DAB顯色，蘇木素復染核，鹽酸酒精分色，脫水、透明、封片。光學顯微鏡拍照。Image軟件分析肺組織中面積積分光密度值，光密度值越大，則notch1陽性越強。

1.2.7 肺組織中MDA、SOD水平檢測:-80℃中取部分肺組織，制備勻漿，硫代巴比妥酸法測定MDA水平、氮藍四唑光還原法測定SOD水平。

1.2.8 WB檢測肺組織Bax、Bcl2蛋白情況:-80℃冰箱取100 mg肺組織，手術剪剪碎后于冰上研磨，每管加1 ml蛋白裂解液冰上裂解30 min，組織勻漿液4℃、10 000 g離心20 min，上清液即為肺組織總蛋白。蛋白定量后經PAGE膠分離、PVDF膜轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉，對應加入一抗Bax、Bcl2、GADPH，4℃孵育過夜；對應加入二抗，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

2 結果

2.1 抑制mir-375對大鼠體重的影響 建模7、14 d，與對照組相比，模型組、mir-375陰性對照組體重降低(P<0.05)；與模型組、mir-375陰性對照組相比，mir-375拮抗劑組體重升高(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠7、14 d體重變化

2.2 抑制mir-375對肺組織形態學的影響 建模7、14 d，對照組大鼠肺組織支氣管完整且排列整齊，肺泡排列整齊；模型組與mir-375陰性對照組肺組織結構不完整，肺泡數量減少、體積增大，結構簡單化；mir-375拮抗劑組肺組織結構有所改善，與模型組相比肺泡數量升高、體積減少。見圖1。

2.3 抑制mir-375對肺組織中mir-375的影響 建模7、14 d，與對照組相比，模型組、mir-375陰性對照組肺組織中mir-375水平升高(P<0.05)；與模型組、mir-375陰性對照組相比，mir-375拮抗劑組肺組織中mir-375水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠肺組織中mir-375水平比較

2.4 抑制mir-375對肺組織細胞凋亡的影響 建模7、14 d，與對照組相比，模型組、mir-375陰性對照組肺組織肺泡上皮細胞凋亡指數升高(P<0.05)；與模型組、mir-375陰性對照組相比，mir-375拮抗劑組肺組織肺泡上皮細胞凋亡指數降低(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 4組大鼠肺組織肺泡上皮細胞凋亡指數比較

2.5 抑制mir-375對肺組織中notch1水平的影響 建模 7、14 d，與對照組相比，模型組、mir-375陰性對照組肺組織中notch1水平降低(P<0.05)；與模型組、mir-375陰性對照組相比，mir-375拮抗劑組肺組織中notch1水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表4。

表4 4組大鼠肺組織中notch1染色光密度值比較

2.6 抑制mir-375對肺組織中MDA、SOD水平的影響 建模7、14 d，與對照組相比，模型組、mir-375陰性對照組肺組織中MDA水平升高，SOD水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組、mir-375陰性對照組相比，mir-375拮抗劑組肺組織中MDA水平降低，SOD水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 4組大鼠肺組織中MDA、SOD水平比較

2.7 抑制mir-375對肺組織中Bax、Bcl2蛋白的影響 建模(7、14)d，與對照組相比，模型組、mir-375陰性對照組肺組織中Bax水平升高、Bcl2水平降低(P<0.05)；分別與模型組、mir-375陰性對照組相比，mir-375拮抗劑組肺組織中Bax水平降低、Bcl2水平升高(P<0.05)。見表6，圖4。

表6 4組大鼠肺組織中Bax、Bcl2蛋白水平比較

圖4 4組大鼠肺組織中Bcl2、Bax蛋白表達情況;A 對照組；B 模型組；C mir-375陰性對照組；D mir-375拮抗劑組

3 討論

早產兒出生時肺發育不成熟，需氧氣支持和機械治療，對氧依賴性強，但長期暴露在高氧環境中極易出現氧化應激現象，導致肺發育遲緩[8]。本研究發現，與對照組相比，模型組體重降低，肺組織結構不完整，肺泡數量減少、體積增大，簡單化，提示BPD導致大鼠體重減輕、肺組織破壞。損害肺上皮細胞可增加氧化應激損傷，誘導細胞凋亡，并與肺損傷程度、肺纖維化關系密切[9]。因此，抗氧化應激被認為是目前減少BPD的重要原因，減少氧化應激改善疾病。

miRNA作為真核生物中參與基因轉錄調控的非編碼單鏈小分子RNA，參與基因轉錄后的表達，從而參與病理生理過程，在血液循環中可作為生物標志物，應用于各種癌癥、自身免疫缺陷疾病等疾病中，疾病發生早期即可檢測到，對于預測疾病及對應治療都存在極大優勢[10,11]。mir-375在進化上高度保守，屬胰腺轉錄因子的關鍵作用靶點，可參與胰腺的發育調控過程，升高mir-375與胰島β細胞的凋亡相關[12]；在Sertoli細胞中mir-375過表達增加活性氧水平并促進細胞凋亡[13]；在血管損傷細胞中mir-375過表達可靶向調控導致炎癥小體水平下降，導致血管病變基因、細胞粘附因子下降，從而減少細胞凋亡[14]。推測mir-375影響細胞凋亡從而影響疾病，但具體機制尚不清楚。本研究發現，與對照組相比，模型組肺組織中mir-375水平升高，提示BPD中mir-375水平升高與肺結構不完整關系密切。與模型組相比，mir-375拮抗劑組肺組織結構有所改善，肺泡數量升高，提示減少mir-375水平可改善肺組織結構，實現對BPD的保護。

氧化和抗氧化失衡是BPD發病的機制之一，MDA作為常見的細胞氧化損傷指標，反映氧化損傷程度；SOD是機體內抗氧化酶，其清除自由基，反映機體抗氧化應激水平[15]。Bax、Bcl2是目前研究細胞凋亡常用基因，Bcl2包括多個同源物，其蛋白主要調控凋亡途徑的阻斷，可阻斷、抑制細胞凋亡信息傳輸過程；Bax可拮抗Bcl2，發揮促凋亡作用[16]。本研究發現，與對照組相比，模型組肺組織中MDA、Bax水平升高，Bcl2、SOD水平降低，提示BPD中肺組織氧化損傷嚴重，抗氧化水平減弱，導致機體氧化應激處于失衡狀態，促進凋亡途徑，減弱抑制凋亡信號傳輸過程，細胞凋亡嚴重，且TUNEL染色中細胞凋亡指數升高可直觀觀察到BPD肺組織肺上皮細胞凋亡嚴重。與模型組相比，mir-375拮抗劑組減弱上述情況，可能是降低mir-375水平使氧化應激向正常方向發展，從而減少細胞凋亡，實現對疾病的保護。

Notch通路屬進化保守信號通路，可調控細胞增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移等過程[17]。notch1在發育不成熟的高氧肺損傷中表達水平顯著降低，促進肺的發展、再生和重建，從而對肺組織起保護和修復作用，恢復其正常形態和生理功能[18]。且研究發現notch1在高氧誘導的肺損傷中調控氧化應激從而影響肺損傷[19]。同時發現miRNA調控notch1影響凋亡，mir-34a可調節notch1信號傳導參與神經元中的神經元凋亡過程，miRNA-34a抑制劑治療可降低動作電位的頻率，激活notch1信號傳導并防止無Mg2+處理的神經元中的神經元凋亡，來抑制癲癇樣放電，從而改善認知功能[20]。本研究發現，與對照組相比，模型組肺組織中notch1水平降低，提示在BPD中notch1水平較低，促使肺細胞再生能力較弱，導致疾病加重。與模型組相比，mir-375拮抗劑組肺組織中notch1水平升高，提示BPD中減少mir-375表達可升高肺組織中notch1水平，從而加速肺再生；同時減弱氧化應激損傷，減少肺上皮細胞凋亡，減輕肺組織損傷，實現對疾病的保護。

綜上所述，mir-375可調節notch通路從而減緩氧化應激損傷，減輕肺上皮細胞凋亡，實現對BPD肺組織的保護。但mir-375與notch通路之間的調控機制有待進一步研究，是本文接下來研究重點。