結核分枝桿菌DNA糖基化酶TagA的表達、純化及晶體學研究

劉作隆，祁 祺，戰博聞，耿 璐，李繼喜

（復旦大學生命科學學院，上海 200438）

結核病被認定為全球十大主要死亡原因之一，其病原體結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）也是最致命的傳染病病原體之一。目前全世界大約四分之一的人口感染了結核分枝桿菌［1］。僅2019年，全球大約就有1 000萬新增病例以及140萬死亡病例。雖然近幾年結核病病例數量正在緩慢下降，但突如其來的一場新冠肺炎疫情很可能使各國政府和世界衛生組織的努力付之一炬。根據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）模型估算的結果，新冠肺炎疫情對公共衛生服務造成的干擾可使得發現和治療的結核病患者人數在3個月內下降25%～50%，最終導致全球結核病死亡人數可能增加約20萬～40萬［2］。因此，結核病仍然是對世界公共衛生安全的一項嚴峻挑戰。

結核分枝桿菌寄生在宿主巨噬細胞中，經常受到各種內源性和外源性因素的DNA損傷攻擊，且基因組完整性對其生存和增殖至關重要［3］。結核分枝桿菌中存在強大的DNA修復系統，不僅確保其遺傳物質的復制準確無誤，而且在結核分枝桿菌的基因組多樣化以及耐藥性的發展中也發揮著重要作用［4］。DNA修復系統中的堿基切除修復（base repair excision，BER）主要用于修復單核苷酸損傷［5-6］，結核分枝桿菌在這一途徑中進化出了顯著的功能冗余。它表達大量的DNA糖基化酶，識別和切除各種受損的堿基和DNA骨架之間的N-糖苷鍵，產生脫嘌呤嘧啶（apurinic or apyrimidinic，AP）位點［7］。糖基化酶可分為單功能酶和雙功能酶，單功能酶僅具有糖基化酶活性，而雙功能酶還具有裂解酶活性，能裂解AP位點的DNA骨架［8-9］。

作為一種單功能3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶，TagA目前僅在原核生物及擬南芥中發現同源序列，在結構上屬于烷基化DNA糖基化酶中的螺旋-發夾-螺旋（helix-hairpin-helix，HHH）蛋白超家族。其中結核分枝桿菌來源Ⅰ型3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶TagA（MtbTagA）共包含204個氨基酸，理論相對分子質量（molecular weight，Mw）為21 005.10 Da，理論等電點（theoreticalpI）為7.72，最早于1998年通過基因組學鑒定出來。一直到2019年，MtbTagA的研究仍然止步于基因層面，幾乎沒有生理功能以及結構性質的相關報道［10］。HHH超家族糖基化酶都有一個保守的天冬氨酸殘基，用于去質子化或穩定糖苷鍵斷裂時在糖上形成的正電荷［11-12］。然而其同源蛋白大腸桿菌來源的TagA（EcTagA）卻不存在這一保守殘基。因此，EcTagA使用Glu38、Tyr16以及Leu44，通過氫鍵連接到6-氨基和N7位［13］，通過與3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3MA）的范德華力相互作用以及與保守的Trp側鏈的傳統π-π堆積來選擇性地將中性的3MA結合在帶正電的堿基上，以此促進受損堿基的識別和去除，維持基因組的正常復制、轉錄和翻譯［14-15］。結核分枝桿菌的BER過程在宿主巨噬細胞維持正常生理過程中起著重要作用［16］。因此，針對BER，尤其是關鍵蛋白MtbTagA的研究可為發掘新型抗結核感染藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

表達載體pSMT3質粒［通過在pET28b（+）質粒的T7啟動子后添加6×組氨酸（histidine，His）-類泛素蛋白修飾分子（small ubiquitin-like modifier，SUMO）標簽改造獲得］為本實驗室保存；Ulp1酶購于BioVision公司；E. coliDH5α以及E. coliBL21（DE3）感受態菌株均購于上海諾唯贊生物技術有限公司；BamHⅠ和XhoⅠ限制性內切酶均購于New England Biolabs公司；卡那霉素、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）等試劑均購于生工生物工程（上海）股份有限公司；Anti-6×His tag一抗以及Goat-Anti-Mouse二抗均購于Abcam公司；3MA和次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）購于MedChemExpress公司；鎳-氮三乙酸（nickel-nitrilotriacetic acid，Ni-NTA）介質、Superdex 200 16/600凝膠過濾層析柱、Superdex 75 10/300 GL凝膠過濾層析柱以及Q Sepharose Fast flow陰離子交換柱均購于GE healthcare公司；蛋白結晶試劑盒JCSG2 Suite、JCSG+Suite、Crystal Screen（HR2-110）、Crystal Screen 2（HR2-112）、PEG/Ion Screen（HR2-126）以及Index（HR2-144）均購于Hampton公司；Wizard I～Ⅳ購于Rigaku公司；蛋白質結晶優化試劑購于Hampton公司和Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1MtbTagA的克隆、蛋白表達及純化

以結核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosisH37Ra（無毒株）基因組DNA片段作為模板擴增獲得MtbTagA的基因（NP_215726.1）；使用雙酶切（酶切位點為BamHⅠ和XhoⅠ）以及同源重組的方法構建表達帶有6×His-SUMO標簽MtbTagA重組蛋白的MtbTagA-pSMT3質粒，經測序鑒定正確后將重組質粒轉化到E. coliBL21（DE3）感受態細胞中用于蛋白表達。當OD600nm達到0.8時，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，在18℃條件下誘導蛋白表達20 h后，于4℃以5 000 r/min離心15 min，收集表達菌株；將菌體沉淀重懸于裂解緩沖液［50 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0）、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑、體積分數為5%的甘油、2 mmol/L β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）、體積分數為1‰的聚乙二醇單辛基苯基醚（nonidet p40，NP40）］中，經高壓破菌儀破碎，然后在4℃下以18 000 r/min離心60 min，去除細胞碎片。將收集到的上清溶液通過Ni-NTA層析柱純化，并在含有30～250 mmol/L咪唑的緩沖液［50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、體積分數為5%的甘油、2 mmol/L β-ME］中梯度洗脫。使用Ulpl酶切除His-SUMO標簽，同時透析降低咪唑濃度。酶切時，MtbTagA的質量濃度為0.05 mg/mL，Ulp1酶的質量濃度為1 mg/mL，透析緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、體積分數為5%的甘油，透析和酶切在4℃下過夜。通過二次Ni-NTA層析柱純化，收集流穿樣品，以去除His-SUMO標簽。再用Superdex 200 16/600、Superdex 75 10/300 GL凝膠過濾層析柱以及陰離子交換柱，通過蛋白質層析純化系統AKTA Purifier（GE）進一步純化MtbTagA蛋白。其中凝膠過濾層析洗脫緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0）、300 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT；陰離子交換柱洗脫緩沖液為A液［20 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0）、2 mmol/L DTT］和B液［1 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0）、2 mmol/L DTT］各500 mL。陰離子交換柱層析的具體方法如下：將蛋白樣品通過AKTA Purifier系統上樣至陰離子交換柱中，并設定梯度洗脫程序為60 min內B液所占洗脫液比例從0%勻速提高至100%，隨后打開UV280、UV260以及電導率的監控設備，用于實時觀測蛋白質、核酸以及鹽離子濃度；將對應的上樣管放入A液和B液中，點擊執行，并對出峰位置處樣品進行收集。使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、考馬氏亮藍染色以及免疫印跡試驗（Western blot，WB）等方法鑒定蛋白性質［17］。

1.2.2 動態光散射分析

在DynaProNanoStar?（Wyatt Technology，USA）的DYNAMICS軟件上完成動態光散射（dynamic light scattering，DLS）。設置溫度為25℃，光源波長為658 nm，固定散射角為90°，待指示燈變綠即可上樣。將MtbTagA蛋白稀釋至1 mg/mL，稀釋緩沖液成分為20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、300 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT。然后將其分為3組：第一組作為對照組添加相同體積的緩沖液；第二組添加終濃度為50 nmol/L的Hx；第三組添加終濃度為50 nmol/L的3MA。室溫孵育30 min后，每組取3個樣品，每個樣品測量10次。統計并分析所采集參數，包括分子半徑（radium，R）、粒度分布（ploydispersity，PD）和不同半徑分子所占質量分數（mass fraction，MF）等。

1.2.3 結晶和數據收集

將MtbTagA蛋白樣品分裝并分別濃縮至1.6、2.3、3.4 mg/mL，采用氣相坐滴擴散法，通過96孔結晶板以及7種結晶試劑盒，使用Gryphon LCP蛋白自動結晶工作站（Art Robbins Instruments）進行晶體初篩，并置于18℃結晶房中。3 d后，發現2.3 mg/mLMtbTagA蛋白在體積分數為22.5%的PEG 4000、100.0 mmol/L Bis-Tris（pH 4.5）、0.2 mol/L Li2SO4條件下出現針狀晶體。驗證其可重復后，將MtbTagA蛋白與初始結晶條件中不同濃度的沉淀劑和不同pH組成的池液以1∶1的體積比混合，并在18℃結晶房通過懸滴擴散法進行MtbTagA蛋白晶體的優化。經過幾輪優化后，篩選出生長狀態較好的晶體。將晶體挑入含有體積分數為25%的甘油做防凍劑的結晶緩沖液中，并在液氮中快速冷凍后保存，X射線衍射數據在BL17U1線站（SSRF，中國）收集。其衍射波長為0.979 3 ?，與探測器間的距離為250 mm。最后通過HKL2000軟件將收集的數據進行整合［18］。

2 結果與分析

2.1 MtbTagA與同源家族DNA糖基化酶蛋白的生物信息學分析

通過MtbTagA的基因序列比對發現，TagA蛋白家族除了在真細菌中普遍存在以外，在擬南芥中同樣發現存在8個MtbTagA同源蛋白（37%～40%的同源性）。然而，在古生菌、酵母或其他低等真核生物以及哺乳動物中沒有發現同源編碼序列。為了揭示DNA糖基化酶MtbTagA的潛在催化活性位點，本文將其和HHH蛋白超家族的其他同源酶類（包括大腸桿菌來源的EcTagA以及傷寒沙門氏菌來源的StTagA）通過氨基酸多序列同源比對以及云深智藥蛋白質結構預測比對（https://drug.ai.tencent.com/）進行分析（圖1）。結果發現：MtbTagA在二級結構上展現出經典的HHH蛋白超家族的特點，由兩段螺旋結構以及中間的短鏈組成；與大腸桿菌來源的EcTagA以及傷寒沙門氏菌來源的StTagA同源性為35%～45%，與其他4種已有結構的同源蛋白同源性為7%～20%（未展示）；它們在MtbTagA的α2、α3、α4、α7、α8、α9、α10這7個α螺旋上存在保守序列，其中亮氨酸、苯丙氨酸占比最高，兩者相同特點為均具有疏水基團的側鏈；在EcTagA的酶活位點（Glu38、Tyr16、Leu44）為高度保守序列。這表明MtbTagA屬于HHH蛋白超家族，這3個氨基酸殘基可能是其催化活性位點和輔助催化的氨基酸殘基。

圖1 Tag家族的氨基酸序列多重對比和同源建模Fig. 1 Multiple comparison of amino acid sequences of Tag family and homology modeling（a）氨基酸序列同源性比對。結核分枝桿菌來源（MtbTagA，結構來源云深智藥預測）；大腸桿菌來源（EcTagA，PDB ID: 1P7M；傷寒沙門桿菌來源（StTagA，PDB ID: 2OFK）；（b）同源建模。紅色代表MtbTagA，青色代表EcTagA，紫色代表鋅原子。(a) Amino acid sequence homology comparison. Mycobacterium tuberculosis (MtbTagA, iDrug Protein Structure Prediction); Escherichia coli (EcTagA, PDB ID:1LMZ); Salmonella typhimurium (StTagA, PDB ID:2OFK); (b) Homology modeling: red represents MtbTagA, cyan represents EcTagA, purple represents zinc atom.

2.2 MtbTagA蛋白的表達與純化

對MtbTagA的基因（NCBI ID: NP_215726.1）進行分析，根據本實驗室改造的pSMT3質粒，設計MtbTagA-pSMT3質粒，如圖2所示。該質粒所表達的重組蛋白6×His-SUMO-MtbTagA一共有322個氨基酸，分子量為36 394.06 Da，等電點為6.30。

圖2 MtbTagA全長重組蛋白的質粒構建框架圖Fig. 2 Plasmid diagram of MtbTagA full-length fusion protein

從圖3a可以看出，雖然重組MtbTagA質粒所表達的重組蛋白6×His-SUMO-MtbTagA在大腸桿菌（泳道1）中表達量較高，但是大部分在沉淀（泳道3）中，并且在二次Ni-NTA梯度洗脫雜蛋白的過程中出現大量灰色絮狀沉淀。因此酶切后二次Ni-NTA的流穿樣品（紅框部分）中蛋白含量較低。如圖3b所示，表達蛋白（泳道1～3）的確含有帶有6×His-SUMO標簽的重組蛋白，并且在Ulp1酶切（可特異性識別SUMO的三級結構）及二次Ni-NTA親和層析后，所得的蛋白樣品（紅框部分）已去除6×His-SUMO標簽。通過多次試驗發現，在1.2.1的裂解緩沖液條件下MtbTagA蛋白溶解度最高。使用Superdex200 16/600凝膠過濾層析柱對去除6×His-SUMO標簽后的MtbTagA全長蛋白進行純化后發現，目的蛋白在91.6 mL洗脫液處出峰，但是存在大小接近的雜蛋白（未展示），因此，利用蛋白在不同鹽離子濃度下對填料的結合能力不同，使用陰離子交換柱對其進行進一步純化。最后在Superdex75 10/300 GL凝膠過濾層析柱上驗證，發現蛋白在13.8 mL的峰上被洗脫出來，其對應分子量約為25 kD，與理論分子量21 kD基本相符合，表明MtbTagA在溶液中以單體形式存在。其洗脫樣品的SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色分析結果如圖3e～3f所示。

圖3 MtbTagA蛋白表達與純化結果Fig. 3 Expression and purification of MtbTagA protein（a）大腸桿菌表達與Ni-NTA純化MtbTagA蛋白樣品的SDS-PAGE檢測結果。1：全菌樣品；2：上清樣品；3：沉淀樣品；4：流穿樣品；5：咪唑濃度為10 mmol/L的洗脫樣品；6：咪唑濃度為50 mmol/L的洗脫樣品；7：咪唑濃度為250 mmol/L的洗脫樣品；8：Ulp1酶切后過二次Ni-NTA的流穿樣品；9：酶切后二次Ni-NTA中咪唑濃度為250 mmol/L的洗脫樣品；M: 蛋白標準品；（b）大腸桿菌表達與Ni-NTA純化MtbTagA蛋白樣品的WB檢測結果。一抗為6×His標簽；1～9以及M所代表樣品與圖a一致；（c）MtbTagA蛋白陰離子交換柱純化結果。MtbTagA（Mw:21 kD）在陰離子交換柱上從32.6 mL的峰上洗脫出來，其對應分子量約為25 kD；（d）MtbTagA蛋白凝膠過濾層析柱純化結果。MtbTagA（Mw:21 kD）在陰離子交換柱上從13.8 mL的峰上洗脫出來，其對應分子量約為25 kD；（e）MtbTagA蛋白陰離子交換柱樣品的SDS-PAGE檢測結果。M：蛋白標準品；FT：流穿樣品；30～38以及70～72：圖c中相應體積（30～38 mL以及70～72 mL）洗脫樣品；（f）MtbTagA蛋白凝膠過濾層析柱樣品的SDS-PAGE檢測結果。M：蛋白標準品； 13～16：圖d中相應體積（13～16 mL）洗脫樣品。(a) The SDS-PAGE analysis of MtbTagA protein samples expressed by E. coli and purified by use of Ni-NTA purification; 1: Whole cell sample; 2: Supernatant sample; 3: Precipitation sample; 4: Flow through sample; 5: Elution sample with imidazole concentration of 10 mmol/L; 6: Elution sample with imidazole concentration of 50 mmol/L; 7: Elution sample with imidazole concentration of 250 mmol/L; 8: Flow through sample of secondary Ni-NTA after Ulp1 digestion; 9: Elution sample with 250 mmol/L concentration in secondary Ni-NTA after restriction enzyme digestion; M: Protein marker; (b) The WB analysis of MtbTagA protein samples expressed by E. coli and purified by use of Ni-NTA purification; primary antibody was anti-6×His tag; the samples of 1～9 and M were consistent with (a); (c) The purification of MtbTagA protein by anion-exchange chromatography. MtbTagA (Mw: 21 kD) was eluted from the peak of 32.6 mL on an anion exchange column with Mw of about 25 kD; (d) The purification of MtbTagA protein by gel filtration chromatography. MtbTagA (Mw: 21 kD.) was eluted at a peak of 13.8 mL, the corresponding Mw was about 25 kD; (e) The SDS-PAGE analysis of MtbTagA protein samples purified by anion-exchange chromatography. M: Protein marker; FT: Flow through sample; 30～38 and 70～72: Elution sample of corresponding volume (30～38 mL and 70～72 mL) in (c) ; (f) The SDS-PAGE analysis of MtbTagA protein samples purified by gel filtration chromatography. M: Protein marker; 13～16: Elution sample of corresponding volume (13～16 mL) in (d).

2.3 底物對MtbTagA蛋白聚集狀態的影響分析

為了探究MtbTagA蛋白的底物對其聚合狀態的影響，我們根據已報道的同源家族蛋白EcTagA（PDB ID: 1P7M）選擇Hx和3MA這兩種底物，分別與MtbTagA蛋白共孵育作為試驗組，通過DLS檢測溶液中粒子的平均半徑（RAVG/nm）以及各組分所占質量百分數（Mass%）。結果發現：對照組MtbTagA的RAVG為（7.54±0.275）nm，粒子半徑為3.1 nm的峰1的Mass%為99.5%，說明在溶液中多為單體存在；而添加Hx與3MA后的RAVG分別為（12.99±2.260）nm和（145.66±30.670）nm；通過One-Way ANOVA檢驗顯著性發現，添加Hx后RAVG無顯著性差異，而添加3MA后RAVG存在極顯著提高，并且溶液中半徑更大的粒子所占的Mass%也更高（圖4）。這說明預測底物3MA與MtbTagA存在相互作用，并能使其蛋白構象發生改變，從而促進MtbTagA蛋白發生聚集沉淀。

圖4 MtbTagA蛋白與底物共孵育DLS分析Fig. 4 DLS analysis of co-incubation of MtbTagA protein with substrate（a）不同條件蛋白溶液平均粒子半徑的比較。白色代表2 mg/mL MtbTagA蛋白，藍色代表2 mg/mL MtbTagA蛋白與50 nmol/L Hx共孵育，紅色代表2 mg/mL MtbTagA蛋白與50 nmol/L 3MA共孵育。數據用三組平行試驗的均值±標準誤表示（n=30），通過One-Way ANOVA計算顯著性；（b）MtbTagA蛋白溶液中粒子分布狀況的單次檢測；（c）添加Hx的MtbTagA蛋白溶液中粒子分布狀況的單次檢測；（d）添加3MA的MtbTagA蛋白溶液中粒子分布狀況的單次檢測。(a) Comparison of the average particle radius of protein solution under different conditions. White represents 2 mg/mL MtbTagA protein, blue represents 2 mg/mL MtbTagA protein co-incubated with 50 nmol/L Hx, and red represents 2 mg/mL MtbTagA protein co-incubated with 50 nmol/L 3MA; the data were expressed by the ± s of three groups of parallel experiments (n=30), and the significance was calculated by Student’s t test; (b) Single detection of particle distribution in MtbTagA protein solution; (c) Single detection of particle distribution in MtbTagA protein solution with Hx; (d) Single detection of particle distribution in MtbTagA protein solution with 3MA.

2.4 MtbTagA蛋白結晶與數據收集

將新鮮純化的MtbTagA蛋白濃縮至2.3 mg/mL，并用于7×96個條件下的初始晶體篩選。在體積分數為22.5%的PEG 4000、100 mmol/L Bis-Tris（pH 4.5）、0.2 mol/L Li2SO4條件下，針狀和片狀晶體在第3天長出。經過幾輪優化后，于第3天在體積分數為18%的PEG 4000、100 mmol/L Na Acetate（pH 5.2）、0.2 mol/L Li2SO4的條件下（條件一）篩選品質較高的晶體（圖5a）。晶體保存于含體積分數為25%的甘油防凍劑的結晶緩沖液中并迅速在液氮中冷凍保存。隨后在上海同步輻射裝置（中國上海）的BL17U1線站上收集X射線衍射數據，最終得到約7 ?分辨率的衍射數據（圖5b）。在2個月后，在體積分數為20%的PEG 4000、100 mmol/L Na Acetate（pH 5.6）、0.2 mol/L Li2SO4的條件（條件二）下發現有質量更高的晶體生長，有望獲得分辨率更高的衍射數據（圖5c）。

圖5 MtbTagA的晶體圖和X射線衍射圖Fig. 5 The crystals and X-ray diffraction image of MtbTagA （a）條件一中MtbTagA蛋白晶體圖。上方兩塊長方體晶體；（b）條件一中MtbTagA蛋白晶體的X射線衍射圖。分辨率約為7 ?；（c）條件二中MtbTagA蛋白晶體圖。中間三塊片狀晶體。(a) The crystal image of MtbTagA on the first condition. Two rectangular crystals are on the top; (b) The X-ray diffraction image of MtbTagA crystal in the first condition. The resolution is about 7 ?; (c) The crystal image of MtbTagA on the second condition. Three pieces of lamellar crystals are in the middle.

3 討論

結核病是目前世界上最致命的傳染病，中國也是受結核病影響最深的國家之一［19］。結核病的致病菌結核分枝桿菌是專性需氧菌，可以侵染全身的組織和器官，并且擁有高度冗余的DNA損傷修復機制。已有研究表明，3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶能夠識別并切除受損堿基，在BER通路中發揮重要作用，從而對抗人體中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）引發的基因損傷，因此對結核分枝桿菌的生存繁殖和耐藥性都有重要意義［20-21］。另外，被用于多藥耐藥結核病治療的一種新藥griselimycins能通過抑制DNA聚合酶滑動鉗蛋白DnaN的酶活性發揮作用［22］。因此，MtbTagA能作為結核分枝桿菌來源的3MA DNA糖基化酶在DNA修復途徑發揮功能，也有望作為結核藥物開發新靶點的潛在來源。

本研究通過氨基酸序列比對分析發現，MtbTagA與EcTagA的同源度在35%左右，但在二級結構上呈現出相似的HHH蛋白超家族特點，并且酶活位點高度保守，且首次在大腸桿菌中成功異源表達并純化了MtbTagA全長蛋白，這對后續的功能研究具有重要意義。通過DLS發現，異源表達的MtbTagA蛋白在溶液中多為單體存在，并且在預測的2種底物3MA和Hx中，只有3MA能夠使其發生極顯著高聚。雖然Hx也能提高RAVG值，但是并不存在顯著性。這暗示我們MtbTagA蛋白可能在底物選擇性上更傾向于偏中性的3MA，這也與Cao等［23］對EcTagA的研究結果一致。同時，晶體生長的條件中存在的鋰離子與EcTagA（PDB ID: 1P7M）結構中存在的鋅離子均為金屬離子，說明金屬離子可能對穩定蛋白結構、輔助其行使生理功能具有一定意義。對MtbTagA蛋白進行的晶體篩選和X射線衍射分析有助于其結構的解析，以便于闡明其催化機制以及與底物結合的特點，為進一步探究DNA糖基化酶蛋白的生化性質和結構性質奠定了基礎。