基于SurvivalMeth數據庫分析NMUR1在乳腺癌中的甲基化狀態及其對預后的作用

張 華，王 耕，王明華，華永永，樊一飛，王 蓓，袁 杰，李文仿，李 志

（1. 十堰市太和醫院（湖北醫藥學院附屬醫院）普通外科，胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室，十堰 442000；2. 中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院普通外科，海口 570000；3. 錦州醫科大學太和研究生培養基地， 十堰 442000）

神經介素U（neuromedin U，NMU）屬于平滑肌收縮多肽，因可以引起子宮（uterus）平滑肌強烈收縮, 故以U命名［1］。NMU及其受體神經介素U受體1（neuromedin U receptor 1，NMUR1）廣泛分布于人體的各個器官，參與調控新陳代謝、應激、攝食行為等多種生理功能，在多種癌癥的發生發展中也具有重要的作用［2］。研究表明，在口腔癌［3］、食道癌［4］、頭頸磷狀上皮細胞癌［5］以及白血病［6］等惡性腫瘤中，NMU和NMUR1的甲基化對于腫瘤的發生發展有十分重要的作用。乳腺癌（breast invasive carcinoma，BRCA）是女性最常見的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的第二大原因，僅此于肺癌［7］。盡管乳腺癌的綜合治療已取得了很大的進展，但其侵襲性生長和易轉移的特點仍是導致死亡的重要原因之一［8-10］。因此，研究與BRCA預后相關的基因對于評價患者的病情和生存具有重要意義。

DNA異常甲基化是癌癥表觀遺傳學的一個基本特征。DNA甲基化相關功能元件（DNA methylation-related functional elements，DMFEs）的異常可導致腫瘤進展中調控基因的功能障礙，從而影響癌癥患者的預后［11］。SurvivalMeth （http://bio-bigdata.hrbmu. edu.cn/survivalmeth）是由李霞教授等國內學者［12］開發的一個研究DMFEs對癌癥預后影響的數據庫，共收集了36種癌癥包含13 371個樣本中的81個DNA甲基化譜。用戶可以用其在不同的數據集中研究他們感興趣的基因，并且可以通過自動化分析與預后相關的DMFEs，包括甲基化水平、相關分析、臨床分析、差異分析等，從而預測癌癥的預后。本文采用SurvivalMeth在線數據庫分析NMUR1在BRCA中的甲基化狀態及其對預后的影響，旨在為NMUR1作為BRCA預后和（或）治療的新靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 NMUR1在BRCA中的表達

使用UALCAN數據庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）［13］的癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）分析模塊分析NMUR1在BRCA腫瘤組織和正常乳腺組織中的表達情況。

1.2 NMUR1在BRCA中表達的驗證

采用人類蛋白質圖譜（the human protein atlas，HPA）數據庫（https://www.protein atlas.org/）［14］中NMUR1在BRCA腫瘤組織和正常乳腺組織中表達的免疫組化結果驗證NMUR1在BRCA中的表達情況。

1.3 NMUR1在BRCA中甲基化水平及預后相關分析

采用SurvivalMeth數據庫［12］分析NMUR1在BRCA中的甲基化水平，同時進行比例風險（COX）回歸分析、Kaplan-Meier生存分析以及胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）島甲基化風險模型分析。在單個基因分析界面，選擇疾病類型為“Breast invasive carcinoma”，實驗平臺選擇“450k”，輸入基因名字“NMUR1”，其中轉錄相關元件、CpG相關元件、重復元素、CTCF綁定區域選擇默認設置，即“Without Restriction”，差異分析的P值設置為0.01。采用t檢驗分析各個探針對應的腫瘤組織和正常乳腺組織中NMUR1甲基化水平的差異，采用COX回歸模型分析NMUR1甲基化水平對患者的生存的影響，采用Kaplan-Meier生存分析研究NMUR1甲基化水平對BRCA患者預后的影響，使用自動化工具構建NMUR1甲基化模型并繪制甲基化模型風險曲線，并比較分析CpG島甲基化高風險組和低風險組患者生存的差異。

2 結果與分析

2.1 NMUR1在BRCA和正常乳腺組織中的表達情況

將UALCAN數據庫中來自TCGA的1 097例BRCA腫瘤組織樣本、114例正常乳腺組織樣本納入分析，結果表明，NMUR1在BRCA腫瘤組織中的表達［0.148 3（0，0.690 4）］比在正常乳腺組織中的表達［1.779 3（0.077 2，8.825 1）］下調（P＜0.001）（圖1）。

圖1 NMUR1在BRCA和正常乳腺組織中的表達情況Fig. 1 Expression of NMUR1 in BRCA tissues of and normal tissues

2.2 HPA數據庫中NMUR1在BRCA和正常乳腺組織中的免疫組化結果

HPA數據庫中NMUR1在BRCA和正常乳腺組織中的表達結果顯示，NMUR1在BRCA腫瘤組織中低表達（圖2a），在正常乳腺組織中高表達（圖2b）。

圖2 NMUR1在BRCA組織與正常乳腺組織中蛋白表達的免疫組化染色Fig. 2 Immunohistochemical staining of NMUR1 protein expression in BRCA tissues of and normal tissues of patients（a）BRCA組織（HPA027895）；（b）正常乳腺組織（HPA027895）。(a) BRCA tissues (HPA027895); (b) Normal tissues (HPA027895).

2.3 NMUR1在BRCA中的甲基化狀態

采用SurvivalMeth數據庫分析NMUR1在BRCA中的甲基化情況，結果顯示，有11個探針NMUR1甲基化水平有顯著差異（P＜0.001）（圖3），8個探針NMUR1甲基化水平無明顯差異（P＞0.05）。由表1可知，NMUR1在BRCA中的甲基化可能存在11個位點，即cg00143376、cg01649597、cg02204630、cg10042319、cg16297948、cg17207690、cg18250832、cg18877969、cg19077400、cg21424120、cg26913833。

表1 NMUR1在BRCA中甲基化顯著差異的結果Tab. 1 The significant result of differential analysis of NMUR1 methylation in BRCA

圖3 NMUR1在BRCA組織與正常乳腺組織中甲基化水平Fig. 3 NMUR1 methylation level of different probes in BRCA and normal tissues

2.4 COX回歸分析

COX風險回歸模型分析發現，在11個甲基化位點中，cg17207690位點NMUR1甲基化對BRCA患者有降低死亡風險的作用［風險比（hazard ratio，HR） =0.001 900，95%CI（5.195e-06，6.940e-01），P=0.037］，其余10個位點NMUR1對BRCA預后無明顯差異（P＞0.05）（表2）。

表2 NMUR1甲基化對BRCA患者預后影響的COX風險回歸分析Tab. 2 COX regression model analysis of NMUR1 methylation on prognosis in BRCA patients

2.5 NMUR1在BRCA中甲基化Kaplan-Meier生存分析

構建NMUR1甲基化模型，按CpG島甲基化風險分為高風險組（n=320）和低風險組（n=461），并繪制CpG島甲基化模型風險曲線。Kaplan-Meier生存分析結果表明，NMUR1在乳腺癌中CpG島甲基化與乳腺癌患者生存顯著相關，甲基化高風險組患者生存率顯著低于低風險組［HR=2.140 300, 95%CI （1.305 4, 3.509 1，P=0.001］（圖4）。由NMUR1甲基化模型風險曲線可知，高風險組患者的預后較低風險組差（圖5）。與低風險組相比，高風險組在cg18877969（P=0.015）、cg16297948（P=0.028）、cg19077400（P=0.011）、cg26913833（P=0.035）位點上的CpG島甲基化水平較高，在cg00143376、cg01649597、cg02204630、cg10042319、cg17207690、cg18250832、cg21424120位點上，兩組的CpG島甲基化無明顯差異（P＞0.05）（圖6）。

圖4 NMUR1在BRCA中甲基化CpG島高風險組與低風險組的Kaplan-Meier生存曲線Fig. 4 The Kaplan-Meier survival curves of NMUR1 methylation at high and low levels of CpGs in BRCA

圖5 NMUR1在BRCA中的甲基化模型風險曲線Fig. 5 Distribution of prognostic index of NMUR1 methylation level in BRCA

圖6 NMUR1在BRCA中CpG島甲基化高風險組與低風險組的甲基化水平Fig. 6 Heatmap of NMUR1 CpGs methylation level in BRCA

3 討論

NMU于20世紀80年代首次在豬脊髓中發現，其及其受體廣泛分布于動物體內，具有廣泛的生理功能，并在生理過程中發揮重要的調節作用［1-2］。NMU在調節平滑肌收縮、內分泌系統、血壓與心率、能量代謝、攝食行為、痛覺及癌癥發生發展等方面具有十分重要的作用［15］。NMU主要通過與其特異性G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCRs），即NMUR1和神經介素U受體2 （NMUR2），結合來發揮作用［16］。NMUR1主要表達在胃腸道、泌尿生殖系統、脂肪組織、淋巴細胞、腎上腺皮質、心臟、胰腺、骨髓、脾、肺、氣管、乳腺、外周血白細胞等外周器官、組織和細胞中，而NMUR2更高效地表達在中樞神經系統中，多數局限在大腦的特殊區域［17］。研究表明，NMUR1的甲基化對多種腫瘤的發生發展有十分重要的作用，包括口腔癌、食道癌、頭頸磷狀上皮細胞癌以及白血病等惡性腫瘤［18-19］。我們通過對UALCAN數據庫中來自TCGA數據庫的1 097例乳腺癌組織和114例正常乳腺組織中NMUR1的表達進行對比分析，發現NMUR1在乳腺癌組織中表達下調，同時對HPA數據庫中NMUR1在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的免疫組化情況進行了進一步驗證。

DNA的異常甲基化與多種腫瘤預后密切相關，研究基因甲基化也是研究腫瘤的診斷和預后，以及尋找治療相關新靶點、新思路的重要方法［20-21］。目前對于NMUR1在BRCA中甲基化研究尚未見相關報道。本文通過SurvivalMeth數據庫研究NMUR1在BRCA中的甲基化狀態，發現NMUR1上有11個位點甲基化水平有顯著差異；通過構建NMUR1甲基化模型，并繪制CpG島甲基化模型風險曲線，研究NMUR1在BRCA中CpG島甲基化水平與患者預后的相關性。Kaplan-Meier生存分析結果也發現NMUR1在BRCA中CpG島甲基化與BRCA患者生存顯著相關，且生存率與甲基化風險相關。與低風險組相比，高風險組在cg18877969、cg16297948、cg19077400、cg26913833位點上的CpG島甲基化水平較高，在其他7個位點CpG島甲基化無明顯差異。經過分析，我們認為NMUR1在BRCA中的甲基化水平與BRCA患者的預后相關。

隨著生物信息學的發展，越來越多學者通過生物信息分析方法研究BRCA的臨床表型、分析機制、甲基化、腫瘤微環境等，為BRCA的預后以及治療新靶點提供新的研究思路和方向［22-23］。國內外生物信息學者開發并建立了TCGA數據庫、HPA數據庫、UALCAN數據庫等各種各樣的生物學數據庫，用于生物學樣本的存儲、下載和分析等。研究者可以通過這些數據庫里龐大的數據進行生物信息學研究。基于生物信息學研究方法，本文首次采用SurvivalMeth數據庫分析NMUR1在BRCA患者NMUR1甲基化狀態及臨床意義。

本文首次采用SurvivalMeth數據庫分析NMUR1在BRCA患者中的甲基化狀態及臨床意義，通過多個數據庫聯合分析，增加了研究的可靠性，但仍需試驗進一步驗證，且NMUR1在BRCA中甲基化及對預后影響的機制也需要進行研究。