基于生物信息學篩選和鑒定結直腸癌 關鍵的生物標志物

張永玲，范文濤

（陜西中醫藥大學基礎醫學院，咸陽 712046）

結直腸癌是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一，致死率在惡性腫瘤中居第三位。根據2018年全美的癌癥統計數據顯示：男性和女性的結直腸癌發病率在各類腫瘤發病率中均居于第三位［1］。該疾病多發生在中年以上的男性，以40～70歲最為常見。隨著人口老齡化以及生活習慣等因素的影響，結直腸癌的發病率和死亡率呈逐步上升趨勢，且越發年輕化，但其發病原因仍然不明。現代臨床早期診斷主要檢測癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）或糖類抗原199（carbohydrate antigen199，CA199）、糖類抗原242（carbohydrate antigen242，CA242）、糖類抗原724（carbohydrate antigen724，CA724），其雖可以診斷結直腸癌，但敏感度不高。越來越多的研究數據發現，基因異常和突變的基因參與結直腸癌的致癌作用和進展，如p53基因、原癌基因K-ras突變、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）、同源異型盒D10（homeoboxD10，HOXD10）基因等。p53是一種重要的腫瘤抑制基因，通過調節不同的下游基因，在多種信號的轉導過程中發揮著重要的作用［2］。原癌基因K-ras是表皮生長因子受體信號通路的下游分子，是引發和治療結直腸癌的關鍵基因［3］。有相關研究發現，有近50%的結直腸癌患者其K-ras基因均發生突變［4］。TLR4是跨膜傳遞信號的受體，可以識別病原病參與相關的免疫應答［5］。根據部分臨床研究發現，TLR4位于外顯子區域的1196C＞T及896A＞G兩個位點的突變最為明顯，其可以改變氨基酸已被編碼的序列［6］。也有研究表明，TLR4基因的多態性對炎性因子的合成過程產生影響，進而引發結直腸癌［7］。郗昌磊等［8］運用蛋白免疫印跡法（Western blot，WB）檢測結直腸癌細胞中HOXD10的表達，發現過表達的HOXD10可以明顯的降低Notch信號通路Notch1及下游靶基因Hesde的蛋白的表達，由此得知過表達的HOXD10可能通過下調Notch信號通路進而影響結直腸癌的發生。目前已發現的可用于診療的分子靶點很多，但仍需不斷尋找有效的靶點。結直腸癌的早期癥狀不明顯，晚期其發病率和死亡率在消化系統的惡性腫瘤中僅次于胃癌、食管癌和原發性肝癌。因此，開發有效的診斷和治療方法至關重要。在近幾十年里，微陣列技術和生物信息學分析日益廣泛用于各類疾病相關基因的分析層面，也更好地幫助我們識別差異表達基因和功能通路參與結直腸癌的致癌作用和進展。然而，通過分析獨立的微陣列數據很難獲得可靠的結果。因此，在本研究中，從基因表達（gene expression omnibus，GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）數據庫下載3個數據集，并通過分析獲得結直腸癌組織和非腫瘤組織之間的差異基因；然后，通過京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析和蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡分析進一步幫助我們理解致癌分子機制。綜上方法所述，472個差異基因和15個核心基因通過分析被確定為有可能是結直腸癌候選的生物標志物。

1 材料和方法

1.1 GEO數據庫

GEO是一個公共功能基因組學高通量基因表達數據的數據存儲庫，包括芯片和微陣列數據［9］。我們從GEO數據庫篩選了3個基因表達數據集GSE21510、GSE32323、GSE15781（均來自于GPL570平臺）。GSE21510數據集包含104個結直腸癌組織樣本和44個癌旁樣本；GSE32323包含22個結直腸癌樣本和22個非腫瘤樣本；GSE15781包含25個結直腸癌樣本和17個非腫瘤樣本。

1.2 篩選差異基因

選擇GEO數據庫自帶分析工具Analyze with GEO2R進行分組，分為癌組織組和正常組織組，點擊TOP250進行分析，保存分析數據。根據P＜0.01，｜logFC｜＞1篩選出差異基因。

1.3 繪制韋恩圖

采用韋恩圖制作軟件（venny2.1），將檢索出的差異基因繪制韋恩圖，查找3組共有基因。

1.4 對共有差異基因進行KEGG和GO富集功能分析

DAVID （http://david.ncifcrf.gov）［10］是一個在線的可視化的生物信息數據庫，整合了生物數據和分析工具，為用戶提供更加全面的基因和蛋白質功能注釋信息，可從中提取生物學信息。KEGG數據庫是系統分析基因產物在細胞中的代謝途徑以及這些基因產物功能的數據庫［11］。基因本體論（gene ontology，GO）是一個主要的生物信息學工具，可以注釋基因和分析基因的生物過程［12］。運用DAVID在線數據庫可以將差異基因的功能和生物分析結果更好地以可視化的方式呈現。P＜0.05被認為具有統計學意義。

1.5 PPI網絡蛋白互作分析（篩選核心基因）

PPI網絡是使用搜索工具（http://string-db.org）來檢索基因相互作用的在線數據庫［13］。通過分析功能蛋白之間的相互作用可以為疾病產生的機制或疾病的發展提供新的見解。STRING數據庫是一個常用的 PPI數據庫，combine score＞0.4被認為是具有統計學意義。Cytoscape是可視化的分子相互作用網絡，為用戶提供了一個開放的生物信息學軟件平臺，內含的插件MCODE（molecular complex detection）是一個應用程序集群，其通過基于給定的差異基因蛋白互作網絡圖發現蛋白互作密集區域，即核心基因所在區域［14-15］。選擇的標準如下：MCODE score＞5，degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，max depth=100，k-score=2。核心基因的KEGG和GO分析模塊使用DAVID可視化呈現。

1.6 核心基因選擇和功能分析

運用Cytoscape中的插件MCODE選擇核心基因。網絡的基因分析使用cbioportal（http://www.cbioportal.org）在線平臺［16］。使用Kaplan-Meier曲線（cbioPortal）對核心基因的總體生存和無病生存進行分析。

1.7 核心基因驗證

使用數據庫Oncomine（http://www.oncomine.com）將正常組織與癌癥組織進行對比分析。

2 結果與分析

2.1 篩選差異基因

從GEO數據庫中篩選3個與結腸癌相關的數據集，通過對數據集中的數據統一處理之后，鑒定出3個數據集的差異表達基因：GSE21510（148個樣本）、GSE32323（44個樣本）、GSE15781（42個樣本）。其中GSE21510中有4 993個差異表達基因，GSE32323中有2 504個差異表達基因，GSE15781中有1 096個差異表達基因。通過韋恩圖（venny2.1）可見3個數據集包含了472個重復基因，其中包括上調基因212個，下調基因260個（圖1a）。

2.2 對差異基因進行KEGG和GO富集功能分析

運用DAVID在線可視化數據庫分析差異基因的功能和富集結果。利用GO分析，將所有差異基因富集到生物學過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和生物學功能（molecular functions，MF）3種生物關系中。分析結果表明，蛋白在生物學過程中主要參與調節細胞增殖、免疫應答、離子傳輸、調節細胞活性、脂質的分解過程等（表1）。細胞學組分主要集中細胞外區域等。生物學功能主要集中于蛋白結合、肽酶的活性、細胞骨架的綁定以及結構分子活動。KEGG通路分析結果顯示，下調的差異基因主要富集在過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated-receptor，PPAR）信號通路、細胞因子與細胞因子受體的相互作用以及醛固酮調節鈉的重吸收，而上調的差異基因主要富集于淀粉和蔗糖代謝TGF-β信號通路等。

表1 差異基因KEGG和GO富集功能分析Tab. 1 KEGG and GO enrichment function analysis of differential gene

2.3 PPI網絡蛋白互作分析（篩選核心基因）

使用STRING數據庫、Cytoscape在線分析軟件對差異基因和核心基因的PPI網絡進行構建（圖1b、1c）。運用Cytoscape中的插件MCODE，根據score排序，選擇出得分最明顯的區域圖1 c，即核心基因。通過DAVID對核心基因的功能進行分析。GO分析結果顯示，核心基因在生物學過程中主要參與蛋白耦合受體蛋白信號通路和細胞表面受體信號轉導，生物學功能主要集中于趨化因子受體結合、細胞和生長因子活動（表2）。KEGG主要富集在趨化因子信號通路以及受體的互動。

表2 核心基因KEGG和GO富集功能分析Tab. 2 Enrichment function analysis of core genes KEGG and GO

圖1 差異基因的韋恩圖、PPI網絡和核心基因Fig. 1 Venn diagram, PPI network and core gene diagram of differential genes（a）在mRNA表達譜集GSE21510、GSE32323和GSE15781中選擇倍數變化＞2且P＜0.01的基因。3個數據集顯示472個基因的重疊，即472個差異基因；（b）使用Cytoscape構建差異基因的PPI網絡；（c）從獲得的PPI網絡中篩選出最重要的模塊，即核心基因。 (a) Select genes with fold change＞2 and P value＜0.01 in the mRNA expression profile sets GSE21510, GSE32323 and GSE15781. The 3 data sets show an overlap of 472 genes, that is, 472 differential genes; (b) Use Cytoscape to construct a PPI network of differential genes; (c) Screen out the most important module, the core gene, from the obtained PPI network.

2.4 核心基因選擇和功能分析

總共15個基因被確定為核心基因。這些核心基因的名稱、縮寫和功能如表3所示。使用cbioPortal在線平臺對核心的基因構建共表達基因蛋白網絡（圖2a）。使用Kaplan- Meier曲線對核心基因的總體生存進行分析（圖2 b），發現結直腸癌患者含有CXCL2、AGT基因，其生存率相比無病生存率較差。

圖2 核心基因的相互作用網絡和生存曲線分析Fig. 2 Analysis of interaction network and survival curve of core genes（a）使用cbioPortal分析核心基因及其共表達基因。黑色粗體輪廓的節點代表核心基因，黑色細體輪廓的節點代表共表達基因；（b）使用cbioPortal在線平臺對核心基因進行總體存活和無病存活分析。 (a) Use cbioPortal to analyze Hub genes and their co-expressed genes. The nodes with black bold outlines represent core genes, the nodes with the black body outline represent co-expressed genes; (b) Use the cbioPortal online platform to analyze the overall survival and disease-free survival of core genes.

表3 核心基因功能Tab. 3 Core gene functions

2.5 核心基因的驗證

利用數據庫Oncomine將基因AGT與CXCL2在正常結直腸組織中的表達與結直腸癌組織中的表達進行對比，結果用箱式圖顯示（圖3）。選取Oncomine數據庫中3個數據集進行進一步驗證（圖4），結果發現，AGT與CXCL2在結直腸癌組織確實呈高表達。

圖3 AGT和CXCL2在正常結直腸組織與結直腸癌組織中的表達Fig. 3 The expression of AGT and CXCL2 in normal colorectal tissues and colorectal cancer tissue

圖4 AGT和CXCL2在Oncomine 3個數據集中的驗證結果Fig. 4 The verification results of AGT and CXCL2 in Oncomine’s three data sets（a）AGT；（b）CXCL2。1.大腸癌與正常Graudens結腸的比較；2.直腸癌與正常Skrzypczak結直腸的比較；3. 結腸癌與正常Skrzypczak結腸直腸比較。Oncomine數據集結果顯示AGT、CXCL2在結直腸癌組織中呈現明顯的高表達。(a) AGT; (b) CXCL2. 1. Colorectal carcinoma vs. normal graudens colon; 2. Colorectal carcinoma vs. normal skrzypczak colorectal; 3. Colon carcinoma vs. normal skrzypczak colorectal. The results of the Oncomine dataset showed that AGT and CXCL2 were significantly over-expression in colorectal cancer tissues.

3 討論

結直腸癌已經成為中國三大癌癥之一，絕大多數的結直腸癌來源于腺瘤，其發病率正以螺旋速度遞增，但其病因仍然模糊不清。結直腸癌并非不可防治，是最易自我篩查的疾病，但其潛伏期較長，早期診斷率較小。

近幾年有關結直腸癌分子機制的研究還是甚少。本研究基于GEO數據庫，選擇3個數據集，篩選出差異基因和核心基因，并對其蛋白互作網絡、分子功能以及生存曲線通過cytoscape、cbioportal等生物信息工具進行分析，最終根據分析結果確定了AGT、CXCL2基因對結直腸癌具有促進作用。就目前，在我們所能查閱到的文獻中，只有1篇文獻研究了AGT與結直腸癌的相關性：AGT不僅可以調節血壓和穩定體液平衡，而且能夠抑制腫瘤細胞的增殖、遷移；AGT M235T多態性與中國人結直腸癌的分化程度密切相關［17］。本研究結果與上述研究結果有所出入，分析原因如下：1）樣本量有限，所以有必要擴大樣本量；2）我們在GEO數據庫中所選取的數據集中的樣本主要來自于日本和挪威，不能排除這種差異是由種族的差異而引起的，所以需要在擴大樣本量的基礎上增加多種族的樣本來源，來獲得更加準確的分析結果；3）我們的研究是一個描述性的研究，還有待功能驗證。CXCL2是一種趨化因子，與CXCR2受體結合參與細胞的增殖和凋亡、腫瘤的形成及其發展，以及干細胞的分化、中性粒細胞的聚集、神經遞質的釋放。宋宏偉等［18］運用免疫組化染色分析結直腸癌及癌旁組織中CXCL2蛋白的表達，結果發現CXCL2表達可能通過某種特殊的途徑影響結直腸組織，從而致癌，但其具體途徑還有待研究。鄭敏［19］運用免疫印跡法、酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測發現，結直腸癌組織及血清中的CXCL2蛋白表達均明顯高于癌旁正常組織。當根據解剖部位分為結腸、直腸時，CXCL2在結腸的高表達比在直腸更加明顯［20］。CXCL2聯合檢測CEA、CA199能夠有效的診斷結腸癌［21］。

本研究旨在識別可能參與結直腸癌的致癌或進展的差異基因。通過對472個差異基因和15個核心基因的識別，發現促癌因子AGT、CXCL2可能被視為對結直腸癌診斷的生物標志物，為后續的研究提供分子靶標。然而，未來還需要進一步的研究來闡明這些基因在結直腸癌細胞中的生物功能及其激活途徑。