基于生物信息學方法的人類GLTP在胰腺腺癌發生發展中的作用及其表觀遺傳調控機制分析

馬梅燕，冀慎英，張湘豫，盧夢云，鄒先瓊

（1. 桂林醫學院附屬口腔醫院，桂林 541004； 2. 桂林醫學院 a. 生物技術學院；b. 基礎醫學院，桂林 541100）

人類糖脂轉運蛋白（glycolipid transfer protein，GLTP）的空間結構是由α-螺旋組成的特別的兩層“三明治”狀結構，這種“三明治”狀結構被認為是真核生物GLTP蛋白家族的結構基礎及原型蛋白［1］。GLTP位于人類12號染色體（基因座12q24.11）上，編碼一個可溶的約24 kD的糖脂轉運蛋白，介導糖鞘脂（glycosphingolipid，GSL）膜間轉運并調節細胞內GSL的穩態水平［2］。GLTP被認為在葡萄糖神經酰胺代謝中發揮作用，其過表達會導致細胞內葡萄糖神經酰胺的合成和轉移顯著增加［3］。然而，決定特定糖鞘脂蛋白選擇性的機制以及GLTP如何結合到目的膜和最終釋放到受體膜的過程仍不清楚［4-5］。特異性蛋白1（specificity protein 1，Sp1）及特異性蛋白3（specificity protein 3，Sp3）能調控GLTP的表達，而神經酰胺處理改變了Sp1及Sp3與GLTP啟動子結合的親和性，降低了Sp3的乙酰化水平［6］。迄今為止，人類GLTP在腫瘤發生發展中的作用及其表觀遺傳調控機制的研究尚未見于文獻。

表觀遺傳調控涉及DNA甲基化、組蛋白修飾和microRNA（miRNA）的作用等，與炎癥、癌癥、神經系統疾病、心血管疾病和自身免疫疾病等的發生發展密切相關。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳調控機制，哺乳動物的DNA甲基化主要發生在胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷（cytosine-guanine dinucleotide，CpG）中［7］。在組蛋白修飾中，組蛋白H3K4Me1的分布可預測轉錄的狀態和啟動子的激活，在與關鍵染色質調控因子的結合中起重要作用［8-9］。組蛋白H3K4Me3存在于真核生物基因組啟動子區域，通常被認為是一種激活的調控方式，可介導基因的轉錄激活，在基因轉錄中具有指示作用［10］。在人紅白血病細胞系K562細胞中，MYB的啟動子區域有激活型的組蛋白H3K27Ac、H3K4Me1的修飾，血紅素誘導分化后，這些表觀修飾的富集度降低［11］。組蛋白H3K27Ac常位于基因的增強子中，在基因轉錄中為激活狀態［12］。其在食管癌放射抵抗細胞中高表達，且富集于OIP5-AS1的啟動子區域［13］。miRNA是內源性合成的約22～25個核苷酸的小的非編碼RNA分子，能通過控制靶mRNA的穩定性和翻譯參與調控關鍵的生物學過程，如細胞增殖、凋亡、分化和血管生成等［14］。

本研究的目的在于通過生物信息學分析研究人類GLTP在腫瘤發生發展中的作用及其表觀遺傳調控機制，為進一步深入闡明人類GLTP的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 人類GLTP序列的獲得

利用美國國家生物技術信息中心NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索人類GLTP，獲得其基因序列號、核酸序列號以及蛋白序列號，并進一步的分析。

1.2 腫瘤組織中的表達及生存分析

通過GEPIA數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/?tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg）分析人類GLTP在胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）腫瘤組織及其癌旁正常組織中的表達情況［15］，并從GEPIA數據庫的子程序“stage plot”中下載PAAD患者的GLTP表達水平的病理分期圖，從而分析GLTP表達水平與PAAD患者病理分期的關系。

1.3 甲基化對GLTP的作用

通過在線服務器cBioportal（https://www.cbioportal.org/）分析人類GLTP在PAAD組織中的甲基化與基因表達的相關性［16］。通過Wanderer在線服務器（http://maplab.imppc.org/wanderer/）分析PAAD組織及癌旁正常組織人類GLTP甲基化程度的差異［17］。

1.4 組蛋白修飾對GLTP的作用

通過在線服務器UCSC Genome Browser（http://www.genome.ucsc.edu/）分析組蛋白修飾對GLTP的調控作用［18］。

1.5 ceRNA調控網絡的構建

通過miRcode在線分析工具（http://mircode.org/）預測可能調控人類GLTP的miRNA種類［19］，并利用DIANA Tools數據庫（http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=site/page&view=software）的子程序MirPath v.3及HMDD數據庫（http://www.cuilab.cn/hmdd?Tdsourcetag=s_pcq q_aiomsg）對這些潛在的miRNA影響的信號通路及經過試驗驗證的相關疾病進行分析。通過DIANA Tools數據庫的子程序LncBase v.2進一步分析得到經過試驗驗證的、與這些潛在作用的miRNA有相互作用且得分較高的lncRNA（閾值為0.539）［20］。通過Cytoscape 3.8.0軟件繪制人類GLTP內源競爭RNA（ceRNA）調控網絡［21］。

2 結果與分析

2.1 人類GLTP序列的獲得

利用美國國家生物技術信息中心NCBI檢索人類GLTP，獲得其基因序列號為NC_000012.1，核酸序列號為NM_016433.4，蛋白序列號為NP_057517.1。

2.2 腫瘤組織中的表達及生存分析

通過GEPIA數據庫分析人類GLTP在多種腫瘤組織及其癌旁正常組織中的表達情況，結果表明，人類GLTP在PAAD組織中的表達水平高于癌旁正常組織，差異顯著（P＜0.05）（圖1a）。這提示GLTP可能參與了PAAD的發生發展。

對GLTP表達水平與PAAD患者病理分期的相關數據進行分析，結果顯示，GLTP表達水平在PAAD患者不同病理分期中的表達差異不顯著（P＞0.05），單因素方差分析得出F值為1.36，其對應P值為0.256（圖1b）。

圖1 人類GLTP在PAAD發生發展中的作用分析Fig. 1 Analysis of role of human GLTP in initiation and progression of PAAD（a）人類GLTP在PAAD組織及其癌旁正常組織中的表達（該圖通過GEPIA數據庫在線分析獲得。圖中紅色箱點圖表示人類GLTP在PAAD組織中的表達水平，灰色箱點圖表示人類GLTP在癌旁正常組織中的表達水平，*P＜0.05。T：腫瘤組織；N：癌旁正常組織）；（b）人類GLTP表達水平與PAAD患者病理分期圖（由GEPIA數據庫中“stage plot”分析獲得）。(a) Expression of human GLTP in PAAD tissues and its adjacent normal tissues (The figure was obtained through online analysis of GEPIA database. The red box dot plot shows the expression level of human GLTP in PAAD tissues, and the gray box dot plot shows the expression level of human GLTP in adjacent normal tissues. *P＜0.05. T: Tumor tissues; N: Adjacent normal tissues); (b) Human GLTP expression level and pathological staging in PAAD patients (Obtained by “stage plot” analysis in GEPIA database).

2.3 甲基化對人類GLTP的調控作用

通過在線服務器cBioportal對人類GLTP在PAAD組織中的甲基化與基因關系進行分析，結果顯示，在178個PAAD病人樣本中Spearman（P=1.439e-4）和Pearson（P=7.002e-4）相關系數的P值均小于0.05（圖2a），表明在PAAD細胞中，人類GLTP的甲基化與其表達水平呈現顯著的負相關性。Wanderer在線服務器分析結果也表明，人類GLTP上游大約500 bp范圍內至少有兩個CpG位點在PAAD組織及癌旁正常組織甲基化程度存在顯著差異（圖2b）。

圖2 人類GLTP甲基化與PAAD的相關性分析Fig. 2 Correlation analysis of methylation of human GLTP and PAAD（a）PAAD組織中人類GLTP甲基化與基因表達的相關性分析；（b）PAAD及癌旁組織中人類GLTP甲基化程度的比較分析。箭頭顯示 GLTP的位置及轉錄方向。CNA: 拷貝數畸變。(a) Correlation analysis of methylation of human GLTP and gene expression in PAAD tissues; (b) Comparative analysis of GLTP methylation in pancreatic cancer and adjacent tissues. The arrow shows position and transcription direction of human GLTP. CNA: Copy number alterations.

2.4 組蛋白修飾對GLTP的作用

通過在線服務器UCSC Genome Browser分析組蛋白修飾對GLTP的作用，結果表明：在K562細胞中，組蛋白H3K4Me1在GLTP的第一外顯子上下游結合水平顯著上升，提示組蛋白H3K4Me1可通過上調GLTP的表達進而影響腫瘤發生發展的進程；組蛋白H3K4Me3在K562細胞內和H1-hsc細胞中的結合水平相似；在K562細胞中組蛋白H3K27Ac在第一外顯子上下游中的結合水平顯著上升，這提示組蛋白H3K27Ac可通過上調GLTP的表達進而影響腫瘤發生發展的進程（圖3）。

圖3 組蛋白H3K4Me1、H3K4Me3及H3K27Ac對人類GLTP的調控作用分析Fig. 3 Histone H3K4Me1, H3K4Me3 and H3K27Ac analysis of human GLTP regulation effect（a）人類GLTP的結構；（b）人類GLTP在對應區域與組蛋白H3K4Me1、組蛋白H3K4Me3、組蛋白H3K27Ac的結合程度。 (a) Genomic structure of human GLTP; (b) The binding degree of human GLTP to histone H3K4Me1, histone H3K4Me3 and histone H3K27Ac in the corresponding region.

2.5 ceRNA調控網絡的構建

通過miRcode在線分析工具預測可能調控人類GLTP的miRNA種類，結果表明，靈長類保守性為56%及以上的miRNA主要包括hsa-miR-27a-3p、hsamiR-125a-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-129-5p、hsamiR-372-5p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-141-3p、hsamiR-125a-3p、hsa-miR-138-5p等（表1）。

表1 通過miRcode分析調控人類GLTP表達的miRNATab. 1 miRNA analysis for regulating human GLTP expression through miRcode

利用DIANA Tools數據庫的子程序MirPath v.3及HMDD數據庫對這些潛在miRNA影響的信號通路及經過試驗驗證的相關疾病進行分析，結果表明，這些與人類GLTP潛在作用的miRNA與多種腫瘤及信號通路存在較強的關聯性。MirPath v3.0及HMDD檢索表明：hsa-miR-27a表達上調抑制乳腺癌、肝癌、胰腺癌等的發生發展［22］；hsa-miR-125a表達上調促進心力衰竭、狼瘡性腎炎、肌萎縮，而抑制黑色素瘤、白血病等的發生發展［23］；hsa-miR-129表達上調抑制前列腺癌的發生發展［24］；hsa-miR-125b表達上調促進前列腺癌、阿爾茨海默病、乙型肝炎病毒感染、口腔鱗狀細胞癌、多發性骨髓瘤等的發生發展［25］；hsa-miR-372表達上調促進睪丸腫瘤、小腦癌、結直腸癌、乳腺癌等的發生發展［26］；hsamiR-141表達上調抑制腎細胞癌的發生發展，其在前列腺癌組織中表達下調［27］；hsa-miR-138表達上調促進肺癌的發生發展，而抑制膽囊癌、心血管疾病、腎細胞癌等的發生發展［28］。

圖4 人類GLTP的ceRNA調控網絡分析Fig. 4 ceRNA regulatory network of human GLTP將miRcode預測得到的miRNA以及DIANA Tools-LncBase v.2分析得到的lncRNA輸入Cytoscape軟件進行構建獲得人類GLTP的ceRNA調控網絡。淺藍色矩形表示lncRNA，藍紫色V形表示miRNA，紅色棱形表示GLTP。The ceRNA regulatory network of human GLTP was constructed by inputting the miRNA predicted by miRcode and the lncRNA analyzed by DIANA Tools-lncBase V. 2 into Cytoscape software. The light blue rectangle represents lncRNA, the blue-purple V-shape represents miRNA, and the red prismatic represents GLTP.

3 討論

胰腺癌是臨床上常見的消化系統腫瘤，其特點是惡性程度高、發現較晚且進展迅速，其主要的病理類型為PAAD［29］。在腫瘤組織中的表達及生存分析結果中，人類GLTP在PAAD組織中的表達水平高于癌旁正常組織，提示GLTP很可能參與了PAAD的發生發展。值得注意的是，GLTP表達水平與PAAD臨床分期差異不顯著，這提示PAAD的發生發展可能受到包括GLTP在內的多種基因的影響，同時還很有可能受其他拮抗因子的影響，但具體原因還有待研究并加以驗證。

甲基化分析結果表明，在PAAD細胞中，人類GLTP的甲基化程度與其表達水平呈顯著的負相關性。而相對于癌旁組織，人類GLTP在PAAD細胞中呈高表達。這些結果提示，在PAAD細胞中，人類GLTP低度的甲基化可能上調了GLTP的表達，進而發揮了促進PAAD發生發展的作用。組蛋白修飾的分析結果表明，組蛋白H3K4Me1和組蛋白H3K27Ac很有可能通過上調人類GLTP的表達進而促進腫瘤的發生和發展。miRNA通過靶向參與細胞增殖、生存、凋亡和轉移相關基因起到抑癌基因或癌基因的作用［30］。將人類GLTP在線分析數據直接輸入到Cytoscape這個可視化的通用平臺，生成圖形化的網絡圖，直觀地展示出了人類GLTP的ceRNA調控網絡。該調控網絡中重要的miRNA、lncRNA的功能及其在疾病中的關系提示了人類GLTP的相關研究方向。

本研究利用了近幾年發展的生物信息學在線網絡分析工具，證明了人類GLTP在PAAD發生發展中可能發揮了重要的作用，并揭示了其可能的表觀遺傳調控機制，為深入研究人類GLTP在腫瘤發生發展中的作用及其分子調控機制提供了參考。