均勻設計法對臨床方劑胃腸炎寧顆粒組方優化研究

浦仕彪，王鉞涵，楊竹雅，劉 錄，周志宏

(云南省高校中藥飲片工程研究中心 云南中醫藥大學，云南 昆明 650500)

胃潰瘍是臨床上常見的一種急、慢性消化系統疾病，由各種致病因子的共同作用，使胃粘膜發生炎性反應、壞死及脫落，進而形成潰瘍，其粘膜缺損壞死穿透粘膜肌層，甚至達到固有肌層及更深處，多表現為噯氣、反酸、饑餓不適、中上腹脹悶、疼痛等，可發生出血、穿孔、幽門梗阻，甚至癌變等并發癥，常反復發作[1].胃潰瘍病因復雜，是綜合因素的結果，與遺傳、精神、飲食、化學、感染、環境等因素相關[2].現代醫學普遍認為胃潰瘍的形成是胃粘膜的攻擊因子與防御因子失衡所致[3]，攻擊因子包括胃酸、胃蛋白酶、幽門螺桿菌、非甾體抗炎藥等；防御因子包括胃粘膜、胃粘液、碳酸氫鹽、前列腺素、細胞更新和上皮生長因子等.胃潰瘍的愈合包括了粘膜層及粘膜下層組織結構的重生、正常生理結構的重建、粘膜層防御功能的恢復等，涉及多種細胞和分子的相互作用，是一個自發的并且非常復雜的過程，其中包含很多不同機制，影響著疾病的發展與轉歸.目前臨床治療胃潰瘍的常用手段主要有抗幽門螺桿菌治療、經典的H2受體拮抗劑(雷尼替丁、法莫替丁等)、質子泵抑制劑(如奧美拉唑、蘭索拉唑、雷貝拉唑等)、胃粘膜保護劑(硫糖鋁、鋁碳酸鎂、前列腺素)、胃腸動力藥(多潘立酮、莫沙必利)等[4-5].盡管西藥靶點明確、療效肯定，但停藥后年復發率高達50%～70%，且長期使用有較大安全隱患，如近年來發現奧美拉唑的致癌性、雷尼替丁原料的基因毒性、粘膜保護劑引起的腹瀉，以及瑞巴派特和替普瑞酮所致的白細胞減少、肝功能損害等，給需要長期、反復用藥的胃潰瘍患者帶來了潛在的安全隱患.

胃潰瘍屬于西醫病名，中醫古籍中并無與之相應的病名，但其癥狀與中醫的“胃脘痛”、“痞滿”、“吐酸”、“嘈雜”等病證相合，可將其歸屬于上述病證范疇，并認為主要由飲食不節、寒溫失調、情志不暢、損傷脾胃引起，其發病機制較為復雜[6].由于中醫藥對胃潰瘍的病因病機分析、臨床表現、藥物治療上均有獨特見解，在預防和治療方面有著豐富的臨床經驗和臨床療效，特別是近年來中藥對胃粘膜保護作用的實驗研究取得了較大進展，為中藥治療胃潰瘍提供了越來越多的證據[7].目前臨床對胃潰瘍的治療主要包括西醫、中醫和中西醫聯合治療3個方面，相比于西醫近期療效好但遠期復發率高和副作用多，中醫中藥在消除胃潰瘍攻擊因子等方面顯示了優勢，其高治愈率、高愈合質量及較強的抗復發作用，為胃潰瘍的治療及防止復發提供了更有效的方法[8-9]，并具有安全性高、價格較低等特點，越來越受到患者青睞.

胃腸炎寧顆粒是我省已故名中醫吳生元教授的臨床經驗方，由美洲大蠊、白芨和鐵皮石斛三味藥組成，具有抗菌消炎、保護消化道粘膜、收斂止血、促進潰瘍組織修復、養陰健胃等作用，對消化性潰瘍療效顯著.為了將該方繼續發揚光大，讓更多胃潰瘍患者獲益，對其進行院內制劑的開發具有積極的社會意義.本文擬采用均勻設計試驗方法，通過簡單、經濟、經典的乙醇致小鼠急性胃潰瘍模型，進行組方優化，為院內制劑開發明確方劑組成.

1 儀器與試劑

DENVER INSTRUMENT電子分析天平，HX602Z型電子天平，248WBJV型海爾冰箱，Milli-Q Integral 超純水機，量筒、燒杯、剪刀、計時鐘等均為國產.

無水乙醇，分析純，含量≥99.7%，500 mL /瓶，天津市風船化學試劑科技有限公司出品，批號20180707；0.9%氯化鈉注射液(生理鹽水)，國藥準字H53020469，500 mL/瓶，昆明南疆制藥有限公司出品，批號A170114d；甲醛(37%～40%)，分析純，500 mL/瓶，廣東光華科技股份有限公司，批號20171018；磷酸二氫鈉，分析純，500 g/瓶，天津市風船化學試劑科技有限公司，批號20151222；磷酸氫二鈉，分析純，500 g/瓶，天津市風船化學試劑科技有限公司，批號20170204.10%中性福爾馬林溶液(分別稱取磷酸二氫鈉 4.000 2 g 及磷酸氫二鈉 6.500 3 g，加入純水溶解、稀釋至約 800 mL，再加入甲醛溶液(37%～40%)100 mL，以純水定容至 1 000 mL，混勻后即可).

SPF級雄性ICR小鼠，5～6周齡，體重24～28 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK(川)2015-030.

美洲大蠊提取物、白芨超微粉、石斛超微粉由云南中醫藥大學鑒定教研室楊竹雅教授鑒定并提供.

2 實驗部分

2.1 均勻設計試驗

按均勻設計原則選用U5(53)表，以美洲大螊提取物(X1)、白芨粉(X2)、石斛粉(X3)3種藥物作為考察因子，每個因子分別取5個水平(即呈梯度遞增的5種不同劑量).

根據美洲大螊提取物(臨床推薦劑量為 0.5 g/次、3次/天)、白芨粉(臨床常用推薦劑量為 3.0 g/天、3次/天)及石斛粉(臨床常用推薦劑量為 3.0 g/天、3次/天)的臨床使用劑量，得出小鼠的等效劑量分別為0.25、0.5、0.5 g/kg，并以此為基礎確定美洲大螊提取物的小鼠劑量范圍0.10～0.30 g/kg、白芨粉和石斛的劑量范圍均為0.20～0.60 g/kg，從低到高各選取5個劑量水平.按照均勻設計表格安排各因子及水平，進行組方設計，得到均勻設計試驗方案，見表1～3.

表1 均勻設計U5(53)表

表2 各因素劑量水平表 (g·kg-1)

表3 均勻設計試驗方案 g

2.2 藥效篩選試驗

選用24～28 g 雄性ICR小鼠132只，按體重隨機分為11組：正常對照；模型對照；陽性對照雷尼替丁 50 mg/kg；美洲大蠊提取物 0.25 g/kg(相當于混合物 1.56 g/kg)；白芨超微粉 0.5 g/kg；石斛超微粉 0.5 g/kg；不同劑量水平配比組方樣品(實驗1～5號)；每組12只.各組動物每日分別按劑量灌胃給藥1次，連續7 d，正常和模型對照組給予純水，容積均為 20 mL/kg.末次給藥前禁食不禁水 24 h，末次給藥后 1 h，除正常對照組外，各模型動物均按 0.1 mL/10 g 灌胃給予無水乙醇.造模 1 h 后，脫頸椎處死動物，剪開腹部，結扎幽門和賁門，并向胃內注射氯化鈉注射液 2 mL，游離、并切下整個胃，置于10%中性福爾馬林溶液中固定 10 min.取出，沿胃大剪彎開，平鋪于玻片上，觀察并按Guth計分標準[5]計算潰瘍指數及潰瘍抑制率.結果見表4及圖1.

Guth計分標準：點狀出血記1分；線狀出血，若寬度<1 mm，糜爛長度<1 mm 記2 分，1～2 mm 記3分，2～3 mm 記4 分，>4 mm 記5分；若寬度>1 mm，以上分值×2.

潰瘍抑制率=(模型組潰瘍指數-給藥組潰瘍指數)/模型組潰瘍指數×100%

由表4和圖1可見，正常對照組小鼠禁食 24 h 后，胃粘膜完整，表面光滑，呈淡粉紅色，無充血和潰瘍等異常變化；與對照組相比，模型組小鼠胃粘膜有廣泛損傷，呈暗紅色，伴隨有大量出血點或糜爛等，其潰瘍指數明顯增高(P<0.01)，表明造模成功.與模型組相比，各給藥組小鼠胃粘膜出血和糜爛情況均有不同程度減輕，其中除美洲大蠊對潰瘍指數的降低僅有作用趨勢而無統計學差異外(P﹥0.05)，其余各給藥組均能明顯降低潰瘍指數(P<0.05/0.01)，提示對無水乙醇致小鼠的急性潰瘍有明顯保護作用.

表4 對無水乙醇致小鼠胃潰瘍的影響

圖1 均勻設計試驗小鼠胃粘膜損傷圖示

2.3 對均勻設計試驗結果進行優化分析

將以上藥效學試驗的結果(潰瘍指數)分別輸入計算機，采用DPS v8.01統計軟件進行均勻設計回歸分析，得出相關指標的回歸方程和最優結果.見表5.

表5 3因素5水平均勻設計試驗回歸方程及結果

2.4 最佳配比

當美洲大蠊提取物(混合物)、白芨、石斛的劑量配比為1.88∶0.6∶0.6 (g/kg)(試驗中的5號樣品)時，小鼠潰瘍指數最低(1.6分)，與模型組相比潰瘍抑制率為76.00%；由回歸方程得出的最佳配比為0.625∶0.20∶0.20(g/kg)，潰瘍指數為2.9分；2組劑量配比基本相當，均大致為3∶1∶1.由此，確定胃腸寧組方中美洲大蠊提取物(混合物)、白芨、石斛的最佳配比為3∶1∶1.

3 討論

均勻設計法又稱為均勻設計試驗法或空間填充設計法，是一種可應用于各個領域的試驗設計方法[10].以中醫藥傳統理論為基點，將數理統計方法的理論與技術結合藥理學實驗對方劑的配伍規律進行研究，并通過對實驗結果的統計分析與綜合評價，可探討復方中藥味配伍與藥理效應變化的相關規律，因此，均勻設計法近年來也被學者應用于復方劑量配伍優化的實驗研究.該研究的關鍵點在于指標的選擇，一般選取最為重要的 1～2 項指標，綜合評估篩選出更優質的配伍處方后，再以此為基礎進行后續的藥學、藥理、毒理等研究，同時要求最終篩選出的處方必須體現原處方的宗旨和立意，這樣才能證明指標選擇的正確性和準確性.

胃腸寧是云南省名中醫吳生元教授的經驗方，由美洲大蠊、白芨和鐵皮石斛三味藥組成，臨床用于胃潰瘍療效顯著.本研究采用均勻設計試驗法，以美洲大蠊混合物、白芨及石斛超微粉為實驗材料，在乙醇致小鼠急性胃潰瘍模型上優化組方中三味藥抑制潰瘍指數的最佳配比，結果顯示：美洲大蠊、白芨、石斛以3∶1∶1的劑量配比時，對無水乙醇致小鼠胃潰瘍有最佳保護作用.