補腎壯骨顆粒對去勢大鼠子宮內膜及ERα、ERβ、GPCR30的影響

袁秋虹 羅駿 李娟敏 彭琪媛 鄧偉民

1.廣東藥科大學，廣東 廣州 510010

2.南部戰區總醫院，廣東 廣州 510010

3.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510010

4.南方醫科大學第三附屬醫院，廣東 廣州 510010

5.前海人壽廣州總醫院，廣東 廣州 511300

骨質疏松癥 ( osteoporosis，OP) 是常見的骨骼疾病，是一種以骨量減少、骨組織微結構損壞以致骨脆性增加易發骨折為特征的全身性骨病[1]。絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMO)的發生與婦女絕經后體內雌激素水平驟降密切相關，臨床中常用雌激素替代療法防治PMO，但長期應用雌激素替代療法會有子宮內膜增生、陰道出血等不良反應，甚至會增加子宮內膜癌的患病風險，因此人們對長期應用雌激素替代療法防治PMO存在較大顧慮。補腎壯骨顆粒臨床中常用于治療骨質疏松癥及更年期綜合征，多年臨床觀察及前期實驗研究發現，補腎壯骨顆粒對PMO亦有良好療效，但臨床中一直沒有補腎壯骨顆粒對子宮內膜不良作用的明確報告。因此，本實驗主要研究補腎壯骨顆粒治療PMO期間對子宮內膜及其雌激素受體α( anti-estrogen receptor alpha antibody, ERα)、雌激素受體β( anti-estrogen receptor beta antibody, ERβ)、G蛋白偶聯雌激素受體30(anti-G-protein coupled receptor 30, GPCR30)表達量的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

補腎壯骨顆粒(顆粒劑，10 g/包，中國人民解放軍南部戰區總醫院藥劑科)；鹽酸雷洛昔芬片(易維特，60 mg/片，美國禮來公司)；戊酸雌二醇片(補佳樂，1 mg/片，德國先靈公司)；anti-estrogen receptor alpha antibody(ERα，英國Abcam公司，ab75635)，anti-estrogen receptor beta antibody(ERβ，英國Abcam公司，ab3576)，anti-G-protein coupled receptor 30(GPCR30，英國Abcam公司，ab39742)；蘇木精伊紅(HE)染色液(leagene，DH0006)；美國GE雙能X線骨密度儀[通用電氣(中國)有限公司，Prodigy]；全自動化學發光成像儀(廣州光儀生物科技有限公司，BIO-OI600)；透反射型系統金相顯微鏡(日本OLYMPUS，BX-51)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及造模：選取6月齡SPF級SD雌性大鼠60只，體重250～300 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2016-0041。SD大鼠飼養于SPF級動物房，投喂SPF級大鼠飼料及滅菌水，自由攝食。適應性飼養7 d，按隨機數字表法分為假手術組(sham-operated group，SOG)、模型組(model group，MG)、雷洛昔芬組(raloxifene group，RG)、戊酸雌二醇組(estradiol valerate group，EVG)、中藥組(Chinese medicine group，CMG)，每組12只。對MG、RG、EVG、CMG 4組大鼠實施雙側卵巢切除以建立絕經后骨質疏松癥模型。具體步驟如下：將10 %水合氯醛以3 ml/kg的劑量行腹腔注射麻醉，腰背備皮，在髂脊直上2 cm與脊柱旁開1 cm交點處縱行開一長約1 cm切口，暴露卵巢，結扎卵巢下端輸卵管，完整切除卵巢，逐層縫合切口，以5 % 碘附消毒切口；SOG大鼠不切除卵巢，僅去除卵巢附近與卵巢同體積的脂肪組織，其余操作與MG、RG、EVG、CMG 4組保持一致。術后立即肌肉注射40 kU/(kg·d)青霉素，持續3 d，防止感染。

1.2.2干預及取材：造模14 d后，各組大鼠恢復情況良好，開始進行實驗干預。RG、EVG、CMG的干預藥品實驗用藥劑量，為臨床用藥劑量通過人與動物體表面積比值換算出的等效用藥劑量，RG雷洛昔芬4.29 mg/(kg·d) ，EVG戊酸雌二醇0.071 mg/(kg·d) ，CMG補腎壯骨顆粒2.5 g/(kg·d) ，灌胃量10 ml/kg，SOG和MG灌服等體積生理鹽水，各組灌胃頻率均為1次/d。用藥干預3個月后，通過隨機數字表法抽取各組半數大鼠，行10 %水合氯醛麻醉后，活體測量股骨及全身骨密度。經腹主動脈采血后將大鼠處死，取出子宮分離多余脂肪，將一側子宮置于液氮中速凍并放入-80 ℃超低溫冰箱凍存，待后續檢測；將另一側子宮用10 %中性甲醇固定，24 h后脫水石蠟包埋。余下半數大鼠繼續用藥干預3個月(總共6個月)。

1.2.3檢測指標及方法

1.2.3.1股骨及全身骨密度：將大鼠在麻醉狀態下行俯臥位固定，舒展脊柱及四肢，進行全身骨掃描檢測，記錄股骨及全身骨密度。

1.2.3.2子宮內膜厚度及直徑長度：通過HE染色觀察組織結構，將子宮石蠟組織塊切片，厚度4 μm，切片二甲苯脫蠟，100 %、90 %、80 %、70 %各濃度乙醇復水，蘇木精染液染核，伊紅染液染質，脫水、透明、封片后，顯微鏡下觀察切片形態，并用Cellscan切片成像系統測量各子宮內膜和直徑的最大值、最小值及另兩對稱點，求得平均值即為子宮內膜厚度及直徑。

1.2.3.3子宮組織ERα、ERβ、GPCR30蛋白相對表達量：通過Western blot檢測蛋白表達，取20 mg子宮組織在200 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(中)冰上充分勻漿裂解，離心取上清，既得總蛋白提取液；測定總蛋白溶液濃度，以含總蛋白30 μg為上樣量，量取各組上樣體積，按比加入相應體積的5×上樣緩沖液，混勻沸水浴5 min；制膠上樣電泳，濃縮膠設置電壓80 V，分離膠120 V；轉膜封閉，5 %脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗孵育，4 ℃過夜，洗膜，二抗孵育，室溫1 h，洗膜；ECL化學發光，全自動化學發光成像儀檢測，應用圖像處理軟件Image J 7.0 對條帶進行灰度分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠股骨及全身骨密度

MG的股骨及全身骨密度在切除卵巢3個月后明顯低于SOG，比較差異具有統計學意義；用藥干預3個月后，RG、EVG、CMG股骨及全身骨密度低于SOG，其中RG、EVG與SOG的差異有統計學意義；RG、EVG、CMG股骨及全身骨密度高于MG，其中RG、CMG與MG的差異有統計學意義；用藥干預6個月后，RG、EVG、CMG股骨及全身骨密度仍低于SOG，但比較差異無統計學意義，RG、EVG、CMG股骨及全身骨密度高于MG，比較差異有統計學意義。見表1。

表1 各組大鼠骨密度的結果

2.2 子宮組織切片形態及直徑和內膜厚度

觀察各組大鼠子宮組織HE染色切片，可知用藥3個月SOG子宮平滑肌層厚度均勻，層次分明內環肌外縱肌界限清晰，肌細胞排列規律，肌層血管散在分布，子宮內膜厚度適中，間質疏松；MG子宮平滑肌層厚薄不一，層次不分明，內環肌外縱肌局部相互交錯界限不清晰，肌細胞排列紊亂，子宮壁呈皺縮狀，肌層血管局部增生擴張充血，子宮內膜厚度明顯小于SOG，間質緊密；RG肌層血管數量較多內膜較薄間質較緊密；EVG肌層血管數量較多內膜較薄；CMG內膜較薄間質較緊密。用藥6個月，各組子宮肌層血管狀態與用藥3個月相似，無明顯變化，但子宮內膜厚度及直徑出現了不同程度的增長，以EVG最為明顯。

測量后可知MG子宮內膜厚度及直徑在切除卵巢3個月后明顯小于SOG，差異具有統計學意義；用藥干預3個月后，RG、EVG、CMG子宮內膜厚度及直徑小于SOG，差異有統計學意義；RG、EVG、CMG子宮內膜厚度及直徑大于MG，其中RG、EVG與MG的差異有統計學意義。用藥干預6個月后，RG、CMG子宮內膜厚度及直徑仍小于SOG，差異有統計學意義；EVG子宮內膜厚度及直徑大于SOG，直徑與SOG的差異有統計學意義，RG、EVG子宮內膜厚度及直徑大于MG，差異有統計學意義，CMG子宮內膜厚度及直徑大于MG ，直徑與MG的差異有統計學意義。見圖1～圖4、表2。

表2 各組大鼠子宮內膜及直徑的結果

圖1 用藥3個月各組大鼠子宮組織HE染色切片圖 (40×)

圖2 用藥3個月各組大鼠子宮組織HE染色切片圖 (100×)

圖3 用藥6個月各組大鼠子宮組織HE染色切片圖 (40×)

圖4 用藥6個月各組大鼠子宮組織HE染色切片圖 (100×)

2.3 ERα、ERβ、GPCR30蛋白相對表達量

用藥3個月后，MG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin小于SOG，差異有統計學意義，RG、EVG、CMG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin大于MG，差異有統計學意義，RG、EVG、CMG的GPCR30/β-actin與MG雖有不同程度的差異但均無統計學意義；用藥6個月，MG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin均小于SOG，RG、EVG、CMG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin均大于MG，差異有統計學意義，MG的GPCR30/β-actin較SOG高，差異有統計學意義，RG的GPCR30/β-actin大于MG，差異無統計學意義，EVG、CMG的GPCR30/β-actin小于MG，差異無統計學意義。見表3。

表3 各組ERα、ERβ、GPCR30蛋白相對表達量

圖5 各組蛋白免疫印跡圖

3 討論

戊酸雌二醇和雷洛昔芬是臨床應用雌激素替代療法防治絕經后骨質疏松癥的常用藥物。戊酸雌二醇是長效雌激素制劑，可緩解去勢所致雌激素缺乏引起的癥狀，減少絕經期骨質疏松癥的發生，促進子宮內膜增生、修復[2]。雷洛昔芬是選擇性雌激素受體調節劑，對雌激素作用組織選擇性表現激動或拮抗作用，在骨骼表現為激動作用，減少骨骼重吸收，降低骨轉換標志物水平，增加骨密度，對子宮內膜無增生作用[8]。補腎壯骨顆粒是由鄧偉民教授研制的中藥復方制劑，具有補腎健脾壯骨作用，多年臨床及實驗研究顯示補腎壯骨顆粒對絕經后骨質疏松癥有明顯治療作用。由本研究亦可看出補腎壯骨顆粒用藥3個月后，中藥組的骨密度雖然低于正常的SOG，但顯著高于去勢的MG，用藥6個月后，中藥組的骨密度雖然仍低于SOG但差異已無統計學意義(P>0.05)；分析CMG、RG、EVG的股骨及全身骨密度可知，用藥3、6個月CMG與RG、EVG的差異沒有統計學意義(P>0.05))，說明補腎壯骨顆粒治療絕經后骨質疏松癥的療效與戊酸雌二醇、雷洛昔芬沒有明顯差異；分析各組子宮內膜厚度可知，去勢后子宮內膜厚度會顯著降低，用藥3個月，CMG、RG、EVG內膜厚度均顯著低于正常的SOG，用藥6個月，CMG、RG內膜厚度仍顯著低于SOG，但EVG子宮內膜明顯增厚高于SOG、CMG、RG，且差異有統計學意義(P<0.05)，說明長期使用戊酸雌二醇會使子宮內膜增厚，而使用補腎壯骨顆粒和雷洛昔芬則不存在這個問題。

雌激素受體ERα、ERβ、GPCR30在正常子宮組織和癌變子宮組織中存在差異性表達。Jarzabek等[3]發現，雌激素核受體ERα和ERβ在子宮內膜癌組織中的表達量較正常組織均有減少，推測核受體ERα、ERβ與子宮內膜癌的發生發展相關。并有研究[4]表明，ERα低表達或表達缺失與子宮內膜癌的惡性轉變呈正相關。Smith等[5]發現，雌激素膜受體GPCR30在癌細胞過量表達，且表達量與癌癥的嚴重程度呈正相關，患者的生存率也隨著GPCR30的超量表達明顯降低。莊研等[6]亦發現，表達陰性的腺癌和腺鱗癌組織中GPCR30蛋白也有高表達。本研究對子宮內膜ERα、ERβ、GPCR30表達進行了研究，用藥3個月，CMG的ERα/β-actin、ERβ/β-actin雖然小于正常的SOG，但明顯大于去勢的MG，GPCR30/β-actin在SOG、MG、CMG、RG、EVG的差異沒有統計學意義(P>0.05)，用藥6個月，CMG的ERα/β-actin小于SOG，ERβ/β-actin大于SOG，但差異均無統計學意義(P>0.05)，GPCR30/β-actin在MG、CMG、EVG的差異沒有統計學意義(P>0.05)，說明補腎壯骨顆粒不會導致ERα、ERβ低表達或表達缺失，也不會使GPCR30 過量表達。

綜上，長期應用補腎壯骨顆粒治療絕經后骨質疏松癥可以提高骨密度，療效與戊酸雌二醇、雷洛昔芬無明顯差異，而且不會導致子宮內膜增厚，也不會導致ERα、ERβ、GPCR30表達紊亂。補腎壯骨顆粒作為中藥復方制劑兼具滋陰補陽、強筋壯骨、祛淤通經等作用，用于防治老年性骨質疏松癥也有良好療效[7]。