酶法制備豆清液多肽工藝優化及其抗氧化活性研究

尹樂斌，劉丹，何平，廖聰，楊愛蓮

(1.邵陽學院 食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000；2.邵陽學院豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南 邵陽 422000)

豆清液又名黃漿水，是豆制品生產過程中的副產物，含有蛋白質、脂肪、糖類等有益成分[1]。近年來，隨著國內豆制品生產規模和產量的逐年上升，豆清液的排放隨之增加，因此開展豆清液加工及利用對于提高豆制品副產物的經濟價值有重要意義。大豆多肽是大豆蛋白的水解產物，具有降血壓、抗氧化、抗疲勞等優點[2-5]，利用豆清液生產多肽可以減少豆清液的浪費，同時也能為企業增添經濟效益。

目前，國內外對豆清液的開發研究多采用微生物發酵法，如制備酵母、釀造白酒、作為豆腐凝固劑等[6]。但由于豆清液微生物發酵多采用液態發酵工藝，發酵過程難以控制，自動化程度低，工藝放大也較困難。為了更好地滿足工業生產的需要，可以使用酶法水解豆清液，和發酵法相比，酶法反應條件溫和、專一性強、副反應少，能較好地保留營養價值。目前，有研究表明胃蛋白酶水解蛋白(如米糠蛋白、苦蕎球蛋白、芝麻蛋白等)可獲得具有抗氧化性的水解物[7-10]；Zhang等[11-12]利用堿性蛋白酶酶解得到大豆水解液對DPPH自由基具有較高的清除率，并利用實驗所得抗氧化肽評估合成肽對氧化的細胞保護作用于人腸道Caco-2細胞的應激反應。蔡沙等[13]利用風味蛋白酶酶解蠶蛹蛋白，結果表明水解液的抗氧化效果較好。為提高大豆蛋白資源的利用率，本研究提出利用不同蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶)水解豆清液制備多肽，借助蛋白酶的水解作用有效地提取豆清液中的蛋白質，并將其轉化為利用效率更高的大豆多肽。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

722型可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；VELOCITY 14R臺式冷凍離心機 Dynamica Scientific Ltd.。

豆清液：由學校果蔬清潔加工實驗室提供；風味蛋白酶：河南萬邦實業有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：Shanghai Chemical Industry Park。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白酶的篩選

取50 mL豆清液，調節pH，再加入木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶酶解數小時，篩選出酶解效果較好的蛋白酶。酶解結束后取出，于沸水中滅酶10 min，室溫冷卻，以體積比1∶1加入三氯乙酸(TCA)溶液，在4000 r/min條件下離心10 min，收集上清液進行測定。

1.2.2 多肽含量的測定

多肽含量的測定參照文獻[14]并稍作改動。取1 mL上清液加入4 mL雙縮脲溶液，搖勻，靜置30 min后，在540 nm處測定吸光值，再用牛血清標準蛋白標準曲線算出多肽含量。按公式(1)計算多肽產率。

(1)

式中：D為多肽產率，%；h1為酶解后多肽含量，mg；h2為酶解前多肽含量，mg。

1.2.3 抗氧化活性測定

將在最優條件下酶解的豆清液進行冷凍干燥，制得豆清多肽凍干粉，再進行DPPH自由基清除率測定，測定方法參考文獻[15]的方法。

1.2.4 單因素實驗

測定風味蛋白酶在不同條件下，即酶用量(0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 g)、酶解溫度(45，50，55，60，65，70 ℃)、初始pH(3.5，4.5，5.5，6.5，7.5)和酶解時間(1，2，3，4，5 h)對水解豆清液的影響。

1.2.5 響應面實驗

在單因素的基礎上，以多肽產率為指標應用響應面分析法中Box-Behnken的實驗設計原理優化出最佳工藝參數，見表1。

表1 風味蛋白酶酶解產豆清多肽的響應面實驗Table 1 Response surface experiment for enzymatic hydrolysis of flavourzyme for producing polypeptide from soybean supernatant

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

分別采用4種不同蛋白酶酶解豆清液得到多肽(見圖1)，其中菠蘿蛋白酶酶解豆清液多肽產率相對較低，為44.74%，風味蛋白酶和胃蛋白酶的酶解效果較好且相差不多，考慮到胃蛋白酶的成本，選擇風味蛋白酶進行后續實驗。

圖1 不同蛋白酶酶解制備豆清多肽產率Fig.1 The yield of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of different proteases

2.2 單因素實驗

2.2.1 酶用量對風味蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響

酶用量對多肽產率的影響見圖2。

圖2 酶用量對風味蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on yield of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of flavourzyme

由圖2可知，隨著濃度比的增長，多肽產率先逐漸增大再減小，原因可能是隨著酶用量增多，酶之間出現競爭性抑制或酶自身相互水解，導致酶活力降低。在6個濃度梯度中，多肽產率最大為47.01%，出現在0.1 g；最小多肽產率為24.57%，出現在0.02 g。選用風味蛋白酶水解豆清液的酶用量為0.08，0.10，0.12 g進行響應面優化。

2.2.2 溫度對風味蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響

由圖3可知，隨著溫度的增長，多肽產率先逐漸加大達到峰值再逐漸減小，曲線整體呈現開口向下拋物線趨勢。蛋白酶作為一種蛋白質類生物催化劑，受溫度的影響較大，在一定溫度范圍內，催化反應的速率隨著溫度的上升而上升，但是超過一定溫度酶逐漸失活，水解能力降低，選用酶解溫度為50，55，60 ℃進行響應面優化。

圖3 溫度對風味蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響Fig.3 Effect of temperature on yield of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of flavourzyme

2.2.3 pH對風味蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響

由圖4可知，隨著pH值的增長，多肽產率先增大，到達峰值再逐漸減小。這可能是由于酶解底物的帶電狀態會因pH的變化而改變。當底物是蛋白質、肽或氨基酸等兩性電解質時，隨著pH的改變，底物呈現不同的解離狀態，酶的活力部位往往只能作用于底物的一種解離狀態，且酶分子的帶電狀態也會隨著pH發生變化，選用初始pH為3.5，4.5，5.5進行響應面優化。

圖4 pH對風味蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響Fig.4 Effect of pH value on yield of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of flavourzyme

2.2.4 酶解時間對風味蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響

由圖5可知，隨著時間的增長，多肽產率先迅速增加后逐漸變緩。出現這種趨勢可能是因為隨著水解的進行，底物濃度下降，多肽含量增加，多肽與蛋白質出現競爭性抑制作用。而酶活力可能隨著溫度或體系pH的改變而降低，出現水解剩余底物能力減弱，或者不具有水解能力。選用酶解時間為4，5，6 h進行響應面優化。

圖5 酶解時間對風味蛋白酶酶解產豆清多肽產率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on yield of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of flavourzyme

2.3 響應面優化實驗

2.3.1 響應面實驗結果

表2 風味蛋白酶酶解產豆清多肽的響應面實驗結果Table 2 Response surface experiment results of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of flavourzyme

續 表

2.3.2 模型建立及顯著性分析

利用軟件Design-Expert 8.0.6.1可以得到回歸方程和方差分析，見表3。

表3 風味蛋白酶酶解產豆清多肽產率方差分析Table 3 The variance analysis of yield of polypeptide from soybean supernatant prepared by enzymatic hydrolysis of flavourzyme

D=+68.23-2.31A-7.88B-1.47C-0.20D-1.87AB+2.56AC-6.09AD+0.75BC-1.98BD+3.09CD-4.30A2-21.72B2-6.25C2-7.85D2。

由表3可知，該多肽產率模型回歸極顯著(P<0.0001)，失擬項F值(有18.03%的可能性是由于干擾)為2.65意味著相對于純誤差而言失擬項并不顯著，且R2=97.03%，RAdj2=94.07%，因此可以用來預測風味蛋白酶水解豆清液生產大豆多肽的工藝。各個因素影響的大小順序為酶解溫度>酶用量>初始pH>酶解時間。

2.3.3 最佳工藝條件的確定

使用Design-Expert 8.0.6.1軟件，得出風味蛋白酶水解豆清液生產大豆多肽的最佳工藝條件為酶用量0.09 g、溫度54.13 ℃、pH 4.33、時間4.12 h。使用該工藝條件，預期大豆多肽產率為69.453%。考慮實際操作，選擇酶用量0.09 g、溫度54 ℃、pH 4.4、時間4 h。經驗證實驗得大豆多肽產率為71.10%，與預測值相比無顯著差異，說明通過Design-Expert 8.0.6.1軟件分析得到的最佳工藝條件是可行的。

2.4 DPPH自由基清除率的測定

由圖6可知，在抗氧化實驗所測定范圍內，豆清多肽凍干粉和Vc對DPPH自由基的清除率均隨著自身濃度的增大而增強，但豆清多肽凍干粉對DPPH自由基的清除能力要弱于VC。當豆清多肽凍干粉的濃度在10 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為67.80%，而當VC的濃度為0.008 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為81.27%，其IC50分別為5.33 mg/mL和0.004 mg/mL。在實驗測定的范圍外，即當VC濃度>0.008 mg/mL和豆清多肽凍干粉濃度>10 mg/mL，兩種樣品對DPPH自由基的清除率還會繼續增大并最終達到100%。研究結果表明，豆清多肽有望被應用到天然抗氧化劑和功能性食品領域，實現利用價值。

圖6 豆清多肽凍干粉對DPPH自由基的清除率Fig.6 The scavenging rates of soybean supernatant polypeptide freeze-dried powder to DPPH free radical

3 結論

本研究以豆清多肽產率為指標，利用響應面法優化風味蛋白酶酶解制備豆清多肽的工藝。結果表明，最優工藝條件為：酶解最優條件為酶用量0.09 g、溫度54 ℃、pH 4.4、時間4 h，在此條件下多肽產率為71.10%；抗氧化實驗結果表明風味蛋白酶酶解豆清液制備的豆清多肽具有較好的抗氧化性，可以作為優質抗氧化肽的良好來源，可為豆清多肽的制備和推廣應用提供理論依據，有利于今后豆清液的再利用。