解淀粉芽孢桿菌S-2發酵優化及培養特征研究

魏鴻剛

摘要：在農業上以解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）為有效成分的農藥和肥料應用越來越廣泛。因此以活菌含量和芽孢率為目的，考察了碳源、氮源、pH、接種量對培養結果的影響。結果表明，采用如下發酵培養基及培養條件：5% 大米粉、2% 豆粕粉、0.05%KH2PO4，0.005%MnSO4， pH6.5-7.5，接種量 1%，培養 48h 時最高活菌含量可達 37.7×108cfu/mL，芽孢率可達 95.4%。此外， 耐鹽試驗表明，S-2 最高能耐受 6% 的NaCl，耐鹽度高，可在鹽堿地或高鹽的污水處理中應用。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌，活菌含量，芽孢率，耐鹽

Abstract： Bacillus amyloliquefaciens has been widely used as the active ingredient in agricultural pesticides and fertilizers. Therefore， the content of bacteria and spore rate in fermentation broth were used as indexes to investigate the effects of carbon source， nitrogen source， pH and inoculation amount on the culture results. The results showed that the optimal medium for fermentation of Bacillus amyloliquefaciens S-2 was 5% rice flour， 2% soybean meal powder， 0.05%KH2PO4， 0.005%MnSO4， the initial pH of fermentation was 6.5-7.5， and the inoculation amount was 1%.The maximum content of bacteria and spore rate reached 37.7×108cfu/mL and 95.4% when the medium was used for 48h. In addition， salt resistance test results show that S-2 can tolerate the highest 6% NaCl， can be used in saline alkaline land or high salt wastewater treatment.

Key words： Bacillus amyloliquefaciens， content of bacteria， spore rate， salt tolerance

解淀粉芽孢桿菌是一種環境友好的好氧型革蘭氏陽性細菌， 菌體呈桿狀，產芽孢，并能減免毒理學資料 [1]。該菌分布廣泛，在植株、灘涂、海水里都能分離得到。由于該菌能產生多種活性物質（如抗生素、抑菌蛋白、脂肽類等），且對多種植物病原細菌和真 ?菌（如青枯病、角斑病、枯萎病、根腐病、稻瘟病、紋枯病等）具 有明顯的拮抗或抑制作用 ?[2-4]。因此世界各國的研究者對其在生物防治、促生長、肥料等方面展開了大量的研究工作[5-8]。國內已申 ?請了解淀粉芽孢桿菌的農藥登記證 8 張，有效成分含有解淀粉芽孢桿菌的肥料登記證 1000 多張 [9]。利用從鹽堿地植物根際分離得到一株解淀粉芽孢桿菌 S-2，開展了培養特性和發酵條件的優化，為S-2 的應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

解淀粉芽孢桿菌S-2：分離至鹽堿地植物根際土壤，純化后， 斜面保藏。

1.2 培養基

種子培養基：LB 培養基。發酵培養基：蔗糖 5%，蛋白胨 2%， KH2PO40.05%，MnSO40.005%，pH7.0-7.5。

1.3 方法[10-13]

1.3.1 種子制備

從 S-2 試管斜面中挑取菌苔至 LB 搖瓶中（50mL/250mL）， 于 30℃、150rpm 下培養 18h 后，劃線培養，于 30℃培養 24h 后， 取單菌落至LB 搖瓶中30℃、150rpm 下培養18h，得到活化后的S-2， 備用。

1.3.2 鹽度對菌體生長影響

以 1.2 中的發酵培養基為對照，通過添加 NaCl 來調節培養基鹽度，分別配制 NaCl 含量為 0%、1%、2%、4%、5%、6%、7%、8% 的培養基，按照 1.8% 添加瓊脂粉，滅菌后，分別倒培養皿。取 1.3.1 中的種子液，劃線培養，觀察不同鹽度對生長的影響。

1.3.3 活菌含量測定、芽孢含量測定及芽孢率測定方法活菌含量測定方法：稀釋涂平板法[14]

芽孢率含量測定：

（1）取培養結束時的發酵液，分裝在 250mL 無菌三角燒瓶中， 每瓶30mL，6 瓶，備用。恒溫水浴鍋（帶震蕩）設置溫度（80±1）℃，待溫度穩定后，備用。

（2） 上述 6 個三角燒瓶， 取 3 個常溫下震蕩 20min， 稀釋涂平板測定活菌含量。取平均值 VCK。另外 3 個三角燒瓶，置于80℃的水浴鍋中恒溫震蕩 20min（震蕩頻率與常溫下的對照相同） 后，立馬取出，自來水降溫至室溫后，稀釋涂平板檢測活菌含量。 ?取平均值V 處理。

（3） 芽孢率R=V 處理/VCK×100%

1.3.4 培養基組分優化

碳源篩選：以 1.2 中的發酵培養基為基礎，分別用 5% 葡萄糖、5% 玉米淀粉、6.5% 大米粉代替 5% 蔗糖，其它成分不變，分裝在三角搖瓶中（50mL/250mL），每個搖瓶接種子液 1mL，30℃、150rpm 下培養 48h 后取樣測定活菌含量、芽孢率。每個處理 3 次重復，取平均值。

氮源篩選：以優化后的培養基為基礎和對照，分別用酵母粉、 ?花生餅粉、黃豆餅粉、豆粕粉代替蛋白胨。其它條件同上。

1.3.5 培養條件優化

考察初始pH（6、6.5、7、7.5、8）和接種量（0.5%、1%、2%） ?對菌株培養的影響。

2 結果與分析

2.1 不同鹽度對菌體生長的影響

不同的微生物對環境中鹽含量的耐受度不一樣，可以利用能 耐高鹽含量的微生物在廢水處理、鹽漬化土壤改良等方面。因此考 ?察不同鹽度對S-2 的生長影響，結果見表 1。

表 1 結果表明，S-2 能夠在NaCl 含量不高于 5% 的培養基中生長， 當NaCl 含量為 6% 時，延長培養時間到 96h，也能觀察到菌體長出。而 7% 和 8% 的NaCl 平板上，即使延長培養時間到 120h，也無菌 ? 體長出。由此可知S-2 耐鹽度高，可以在鹽堿地的作物上應用。

2.2 不同碳源對培養結果的影響

不同碳源對S-2 的培養影響結果見圖 1。由該結果可知，不同的碳源對 S-2 的培養結果有一定的影響。以葡萄糖為碳源的培養基，接種后，菌體生長迅速，在 36h 時活菌含量達到最高，然后開 20始進入衰退期。由于葡萄糖作為速效碳源，所以消耗速度快，芽孢在 ? 24h ? 時就開始形成，但在芽孢大量形成時，其活菌含量下降明顯。 ? ? 18綜合考慮活菌含量、芽孢率、成本，選擇大米粉作為S-2 的碳源。

2.3 不同氮源對培養結果的影響

以大米粉作為碳源，考察不同氮源對 S-2 培養的影響，培養結果見如下圖 2。

由該表數據可知，酵母粉、花生餅粉、黃豆餅粉、豆粕粉的 添加有利于芽孢生成時間提前。接種后，CK（氮源為蛋白胨）和 ? 花生餅粉的菌體生長進入對數生長期。而以豆粕粉為氮源，先進入 ?遲緩期，再快速進入對數生長期，在 48h 時，活菌含量達到最高為37.7×108cfu/mL，芽孢率為 95.4%。綜合考慮發酵的活菌含量和芽孢率，選擇豆粕粉作為S-2 培養的合適氮源。

2.4 pH 對培養結果的影響

微生物對環境的 pH 比較敏感，合適的 pH 環境有利于菌體的快速生長繁殖。本實驗考察了不同的初始 pH 對培養結果的影響。結果見圖 3。由該數據可知，初始pH 在 6.5-7.5 之間，發酵后期能保持活菌含量和芽孢率維持在一個比較高的水平。

2.5 接種量對培養結果的影響

接種量的大小不僅涉及到發酵規模放大后生產線的配套建設， 而且對活菌的生長代謝影響較大。考察了 0.5%、1%、2% 的接種量對培養結果的影響，結果見如下圖 4。

由該數據可知，3 個接種梯度下，菌體立即進入對數生長期， 并在 12h 時活菌含量相差不大，培養到 24h 時，0.5% 和 2% 接種量的進入緩慢衰退期，而接種量為 1% 的，還在緩慢上升。2% 接種量最先產生芽孢，在 48h 時，1% 接種量的芽孢率要高于 2% 的。因此綜合考慮活菌含量和芽孢率，選擇 1% 作為S-2 培養的合適接種量。

3 討論

目前國內外關于解淀粉芽孢桿菌的研究越來越多，特別是在 綠色農業可持續發展的大背景下，國家和農戶對環境友好、安全高效的以微生物為有效成分的農藥和肥料需求越來越強烈。本實驗室篩選到一株對植物病原細菌和病原真菌具有明顯抑制作用的細菌——解淀粉芽孢桿菌（Bacillus ?amyloliquefaciens）S-2。考察了碳、氮、pH、接種量對培養結果的影響。后續還需進一步將發酵規模逐級放大，以驗證和完善發酵工藝，為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）S-2 的產業化開發奠定基礎。

參考文獻

[1]NY/T1109-2017，微生物肥料生物安全通用技術準則

[2] 陳哲，黃靜，趙佳，王長彪，梁宏，解淀粉芽孢桿菌抑菌機制的研究進展[J]，生物技術通報，2015，31（6）：37-41

[3] 關曉歡，姜華，解淀粉芽孢桿菌研究進展[J]，生物技術世 界，2013（1）：4，9

[4] 陳士云，楊寶玉，高梅影等，一株抑制油菜核盤菌菌核形成的解淀粉芽孢桿菌，應用與環境生物學報[J]，2005，11（3）： 373-376

[5] 趙曉宇，王佳龍，孟利強等，解淀粉芽孢桿菌發酵技術在生 物防治領域的研究進展 [J]，黑龍江科學，2015，6（4）：18-20

[6] 王英國，王軍華，權春善，范圣第，解淀粉芽孢桿菌活 菌活性物質的分離純化及抑菌活性研究 [J]，中國生物工程雜志， 2007，27（12）：41-45

[7] 楊帆，李新民，劉春來等，解淀粉芽孢桿菌抑菌活性初步研究[J]，黑龍江農業科學，2015（9）：55-59

[8] LIU Wei-wei， MU Wei， ZHU Bing-yu， et al. Antagonistic activities of Volatiles from four strains of Bacillus spp. andPaenibacillus spp. against soil-borne plant pathogens[J].Agricultural Sciences in China， 2008，7（9）：1104-1114

[9] 農業農村部微生物肥料和食用菌菌種質量監督檢驗測試中心（http：//www.biofertilizer95.cn/zhdjcpml）

[10] 劉京蘭，薛雅蓉，劉常宏，內生解淀粉芽孢桿菌 CC09 產Iturin A 搖瓶發酵條件優化[J]，微生物學通報，2014，41（1）： 75-82

[11] 魏嬌洋，馮龍，李亞寧等，內生解淀粉芽孢桿菌 X-278 發酵條件的優化[J]，北方園藝，2014（05）：106-110

[12] 洪鵬，安國棟，胡美英等，解淀粉芽孢桿菌 HF-01 發酵條件優化[J]，中國生物防治學報，2013，29（4）：569-578

[13] 章小洪，汪琨，朱延恒等，解淀粉芽孢桿菌 BW-13 培養基和培養條件優化 [J]，浙江工業大學學報，2013，41（1）： 35-39

[14] NY/T 2321-2013，微生物肥料產品檢驗規程

（1. 上海頡賽實業有限公 上海 201101 2. 蘇農（廣德）生物科技有限公司 安徽 242000）